| 研究課題/領域番号 |
16K05509
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
高橋 浩 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (80236314)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | コレステロール / リン脂質 / シトクロムP450 / 薬物代謝 / ホスファチジルコリン / ホスファチジルエタノールアミン / 細胞膜 |
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| 研究実績の概要 |
油溶性薬剤の大半は、肝臓の肝細胞内小器官である小胞体膜にある膜タンパク質シトクロムP450（CYP）で代謝される。これにより水溶性が増し、尿と共に素早く体内から排出さされやすくなる。結晶構造学的研究と分子動力学計算から、CYP基質薬剤は、小胞体膜のリン脂質二重層膜内部に侵入した後、脂質膜の疎水内部に入口が開いているチャンネルを通って、活性部位に到達することが示唆されている。この過程からすると、CYPが存在しない他の細胞内小器官の脂質膜に薬剤が侵入すると薬剤は、そのまま膜内に留まり続け、生体機能的には好ましくないと考えられる。選択的にCYP基質薬剤をCYPの存在する小胞体膜に導く機構があるのと考えられ、その機構の解明が本研究の究極の目標である。
本研究で着目したのは、小胞体膜のコレステロール含量が約10%程度と、他の細胞内小器官の脂質膜、例えば形質膜で30%程度などと比較して低い点であった。現在、各細胞内小器官のコレステロール濃度に注目し、モデル系で研究を進めている。
昨年度までは、主にモデル系としてリン脂質ホスファチジルコリン（PC）とコレステロールから成る二成分系を使い、CYP基質薬剤であるクロルゾキサゾン（CZX）のそのモデル膜への結合・侵入が、どうコレステロール濃度に依存するかを調べた。小胞体膜のコレステロール濃度に近いコレステロール10mol%の時に最大となり、それ以上では、CZXの結合・侵入を阻害することを明らかにした。
本年度は、ホスファチジルエタノールアミン（PE）・コレステロール系に関して実験を行った。実験方法としては、透析法を用いた。その結果、CXZのそのモデル膜への結合は、コレステロール濃度5-15mol%付近で最大になり、30mol%程度の高濃度ではPC系と同様に、結合を阻害することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度までの研究で、小胞体膜の主要リン脂質であるホスファチジルコリン（PC）とコレステロールから成る系で実験を行い、小胞体膜のコレステロール濃度に対応する10mol%程度で、CYP基質薬剤であるクロルゾキサゾン（CZX）の脂質膜への侵入・結合が、コレステロールを全く含まないPC膜や30-50mol%程度の高濃度でコレステロールを含むPC膜よりも、高くなることを見出し、モデル系での実験結果はあるが、我々の仮説を支持する成果を得た。
次に、検証しようとした状況は、CYP基質薬剤がトランスポータで肝細胞内に導かれた時、小胞体膜の方には侵入して行くが、形質膜の細胞質側、つまり、形質膜の内膜の方へは侵入して行かないのか、どうかをモデル系で検討することにした。この際に、注目したのは、膜の内膜と外膜におけるリン脂質の非対称分布である。小胞体膜では、リン脂質分布に非対称はなく、内膜と外膜でリン脂質種分布に差がないとされている。一方、形質膜では、非対称性があり、形質膜全体としては、PCが最も含有量の多いリン脂質であるが、それは外膜に主に存在し、内膜では、ホスファチジルエタノールアミン（PE）の方が遥かに多いとされている。
そのため、2017年度は、PE・コレステロール系で実験を行い。PC系とほぼ同じ傾向を得た。ただし、使用した実験方法が透析法であるために、CYP基質薬剤のCZXが膜表面に結合しただけなのか、それともリン脂質膜の疎水性内部まで侵入したかの判定は出来ていない。
また、他のCYP基質薬剤であるテオフィリンでも実験を行う計画であったが、現在進行中で、最終結果は、まだ得られていない。
モノアシルグリセロール・水系でのX線回折の結果を、2017年度論文発表した。この論文で述べたX線回折強度解析方法は、本研究でも膜内における薬剤位置決定には適用できる有用なものである。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで1種類のリン脂質、つまり、PCやPEとコレステロールから成る脂質2成分系のモデル系として採用してきた。しかしながら、実施の生体膜の極めて複雑な脂質構成を考えると、あまりに単純化しすぎているとも言える。小胞体膜と形質膜の内膜のどちらへCYP基質薬剤が結合・侵入しやすいか、を考える場合、リン脂質を2種類にした方が、より現実に近い系となることは間違いない。含有量で第2位までのリン脂質を考えると、小胞体膜でPCとPEとなる。一方、形質膜の細胞質側の膜（内膜）では、PEとホスファチジルセリン（PS）が主要リン脂質の1，2位である。そこで、今後の研究推進の方針として、PC/PE/コレステロールとPE/PSコレステロール三成分系でCYP基質薬剤の膜への結合・侵入がコレステロール濃度により、どう変化するかを調べることとする。
また、これは引き続きの方針であるが、CYP基質薬剤の三成分系のモデル膜膜中での存在位置の決定に関しても研究を進める予定である。実験方法としては、Ｘ線回折強度データから電子密度分布を再構成することから薬剤位置を決定する方法を試みる。
薬剤の種類もクロルゾキサゾンだけに限定するのでなく、他のCYP基質薬剤へも拡張する方針である。
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