| 研究課題/領域番号 |
16K05696
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
根平 達夫 広島大学, 総合科学研究科, 准教授 (60321692)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 円二色性 / 蛍光 / タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、研究代表者の開発した楕円鏡型蛍光検出円二色性（FDCD）測定装置を用いて、有機小分子やタンパク質の立体構造解析に適用可能な、全く新しい迅速で簡便な方法を開発することである。FDCDを構造解析に適用するにはスペクトル曲線の解釈が鍵となるが、現在知られているFDCD理論から予測されるのとは異なり、ある条件の下ではFDCDは透過光CDと異なる曲線を与える。本研究ではこのFDCDとCDの差異の正体と、この差異が観測される条件を明確に定義したい。このため、有機小分子では透過光CDの理論曲線と蛍光寿命の間に起こり得る励起状態の変化をFDCDと関連づけることを、タンパク質ではFDCDを「立体構造のピンポイント解析法」として確立することを、本研究の課題として設定した。
有機小分子を使った実験で、励起子キラリティー系の単純な分子ですらFDCDが透過光CDと異なる曲線を与える例があることが分かった。さらに、タンパク質の部分構造でもあるトリプトファン（Trp）のFDCDスペクトルも、透過光CDとは異なる曲線を与えた。現在は既知FDCD理論の修正点を探るため、量子化学計算により関連分子の系統的な電子遷移モーメントの解析を進めている。
タンパク質のFDCDについては、内在性の蛍光アミノ酸残基であるトリプトファン（Trp）に着目し、Trp含有ペプチドによる系統的なライブラリーによりFDCDの解析を進めている。この中で、蛍光基周辺の局所構造をFDCDとしてどう定義するかが重要と考え、固相合成によって系統的に用意した様々な長さと配列をもつTrp含有オリゴペプチドのFDCDを解析した。現在までに、TrpのC末端側のペプチド鎖伸長によりFDCDは変化するが、N末端側のペプチド鎖は影響しないことが示された。さらにペプチド鎖がFDCDに影響するのは、ペプチド結合部分に絞り込めることも分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
タンパク質の新しい立体構造解析法の確立を目指す先行研究において、CDでは追跡しにくい三次構造の変性をFDCDにより追跡できることが示唆されている。これを受けて昨年度までに、タンパク質内在性の蛍光性アミノ酸であるトリプトファン（Trp）および関連するオリゴペプチドのFDCDスペクトルを解析した。
タンパク質を模した最も単純な実験系として、前年度までに、系統的なTrp含有ペプチドを合成して編成したライブラリーのFDCDスペクトルを解析した。その結果、Trp含有タンパク質のFDCDは、立体構造変化は235 nmに観測されるTrp由来の単一ピークの強度変化に集約されること、このFDCDの強度変化はTrpのC末端側でのペプチド鎖伸長にのみ依存し、N末端側のペプチド鎖は影響しないことが分かっている。この単一ピークへの集約を一般化して理解するため、現在までに量子化学計算によって既知のFDCD理論を修正する道筋を模索している。その一方、同一分子内に異なる蛍光基質を併せ持つ場合のFDCDを実験的に調べるため、蛍光ラベル化によりエネルギー移動（FRET）を利用する方法を検討している。FRETモデルの「物差し部」として剛直なオリゴプロリンを選択し、そのN末端にグリシン、C末端にシステインを特異的な連結基として導入したペプチドを設計し、プロリン残基数の異なる数種類のペプチドを固相合成により合成した。次に「キラルドナー部」として蛍光基を側鎖にもつ糖誘導体を、さらに「アキラルアクセプター部」としてアントラセン誘導体をそれぞれ設計した。現在まで、それらの物差し部への導入を検討しているが、効率の良い合成ルートは見いだせておらず、現在はこれらの再設計を行い、「キラルドナー部」はその側鎖を伸張することで「物差し部」と連結することを、「アキラルアクセプター部」は市販の蛍光タグを利用することを計画している。
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| 今後の研究の推進方策 |
Trpのような単純な分子でも、通常の透過光CDスペクトルと研究代表者らの開発したアーティファクトのないFDCD測定装置とで、互いに異なるスペクトル形状を示した。現在のFDCD理論はこれを合理的に説明できるものではないため、既知のFDCD理論は修正が必要である。研究代表者は様々な有機小分子について、量子化学計算によって得られる分子軌道がCDスペクトルをよく再現できることを見出してきた。これを起点として、量子化学的に予測されるTrpの旋光強度を精査することによって、現在のTrp含有ペプチドのFDCDスペクトルをよく再現する電子遷移を抽出する。この方法をTrpの関連化合物に段階的に適用することによって、CDおよびFDCDスペクトルを普遍的によく説明する説明を見出し、FDCD理論を再構築する。
これと並行して実験的な検討を継続し、蛍光性のオリゴペプチドのライブラリーを合成する。蛍光ラベルの特性を合成段階で制御することで、ペプチド鎖由来の相互作用と芳香族性残基由来の相互作用を実験的に分離し、理論的に予想されている2つのFDCD（蛍光基周辺の局所立体構造のFDCD と離れた複数の局所構造間の相互作用によるFDCD）のそれぞれを独立に観測する方法を検討する。オリゴプロリンの棒状配座を「物差し部」として利用して、蛍光基として「キラルドナー部」と「アキラルアクセプター部」を擁したFRETモデルを採用し、ペプチドの長さを制御することでFRETの効率を変化させる。「キラルドナー部」の特徴的なFDCDスペクトルが「アキラルアクセプター部」を通してどのように観測されるかを評価する。ここまで合成の低収率が問題であったが、今年度は各部分構造の見直しを行い、「キラルドナー部」はその側鎖を伸張することで「物差し部」と連結させ、「アキラルアクセプター部」は市販の蛍光タグを利用することを計画している。
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