| 研究課題/領域番号 |
16K05706
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| 研究機関 | 明星大学 |
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研究代表者 |
松本 一嗣 明星大学, 理工学部, 教授 (90260215)
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| 研究分担者 |
須賀 則之 明星大学, 理工学部, 准教授 (00396219)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ヒト血清アルブミン / ニトロアルドール反応 / ピキア酵母 / 光学活性ニトロアルコール / 組換えタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
前年度までにピキア酵母の組換えタンパク質発現株RKY005をpPICZαAプラスミド（Invitrogen）により構築した。この株から分泌発現したHSAを硫安沈殿と脱塩カラムにより粗精製したHSAでは、ニトロアルドール反応の不斉触媒活性が得られなかった。粗精製画分に塩やその他の阻害物質が含まれており、さらなる精製が必要であると考えられ、より多くのHSAを発現する株が必要となった。そこで、さらに発現量を増やすため新たな発現系であるPichiaPink Expression System（Invitrogen）の構築を進めた。pPink-HC及びpPink-LCプラスミドにHSA遺伝子を分泌シグナルを残したままクローニングし、pTH037とpTH038を構築した。さらに、pTH038をピキアピンク株1と4に導入し、HSA分泌発現候補株を複数得た。現在、これら候補株から、HSAを大量に分泌発現するピキア酵母株を選択している。一方、不斉ニトロアルドール反応の活性測定のための反応系の構築も行った。最もエナンチオ選択性が高い結果を与える、4-phenylbenzaldehydeを基質として反応条件を最適化することで、少量のHSAを用いる反応でも、十分な反応性を示すことを明らかにした。これにより、反応を簡便にアッセイすることが可能になった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
不斉触媒活性を有するHSAの大量調製のための新規発現株候補が得られている。これら株からHSAを大量に精製し、精製ステップを多段階にすることにより、活性を有するHSAを調製できると考えている。また、不斉反応の簡便なアッセイ系の構築も達成しており、調整したHASを用いた活性測定を容易に可能だと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
・得られた候補株からHSAを大量に発現するピキア酵母株を選択する
・得られたピキア酵母株から、多段階の精製を行い、大量のHSAを調製する。
・そのHSAのニトロアルドール反応の不斉触媒活性を調べる。
・不斉活性触媒活性を有すHSAが調製され次第、そのピキアピンク発現系でのHSA変異体の発現株の構築を進める。
・様々な芳香族アルデヒドを用いた反応を行い、有用な種々の光学活性ニトロアルコールを合成する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）年度末に行う予定だった実験が、仕事の都合上、行うことができなかったので、その分、次年度繰り越す必要が生じたため。
（使用計画）次年度早々に予定の実験を行うので、その分の試薬を購入する。
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