| 研究課題/領域番号 |
16K05804
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
古川 潤一 北海道大学, 医学研究院, 特任准教授 (30374193)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | O-結合型糖鎖 / グライコミクス / プロテオミクス / β脱離反応 |
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| 研究実績の概要 |
O-結合型糖鎖の解析については構造非依存的に切り出す酵素がないため、糖鎖の遊離は化学手法に依存しているのが現状である。申請者が開発を進めているBEP法は、ピラゾロン共存下でβ脱離反応を行う方法であり、糖タンパク質からのO-結合型糖鎖の切断と標識を 同時に行う解析法である。さらにBEP法ではβ脱離・マイケル付加反応による化学修飾法(BEMA法)と同様の作用機序で脱グリコシル 化ペプチドにピラゾロン試薬をマイケル付加できるため、糖タンパク質のO-結合型糖鎖結合部位の同定に応用することが可能である。 リン酸化を受けたタンパク質もβ脱離・マイケル付加反応によりピラゾロン試薬で標識されるため、昨年度は、プロテインフォスファターゼ処理を行い、続いてBEP反応を行なった結果、脱グリコシル化ペプチドが選択的にピラゾロン標識できることが明らかとなった。今年度はプロテオミクス解析で一般的に用いられている還元アルキル化やトリプシン消化によるサンプル調整法を検討する。また、N-結合型糖鎖のシアル酸の結合様式を判別するための方法として、シアル酸結合様式特異的誘導体化法（SALSA法）が報告されているが、本研究ではO-結合型糖タンパク質解析への適用について検討を進め、シアル酸の誘導化による結合様式の識別について検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
血清の糖タンパク質/ペプチドの調整を行うにあたり、プロテオミクスで一般的に行われている還元アルキル化について検討を行った。還元アルキル化後にエタノール沈殿法によりタンパク質を回収しBEP法を行った結果、O-結合型糖鎖が効率よく回収できることが明らかとなった。エタノール沈殿により固相抽出カラムによる還元アルキル化剤をすることなく回収タンパク質をトリプシン消化でき、LCMS解析が可能になった。またSALSA法にについてもエタノール沈殿法によりアミド化試薬を効率よく除去することができ、70％程度がアミド化修飾できることが明らかとなった。最終年度は反応収率の向上について検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度は、調整した糖ペプチドの解析を進めて行くが、一つの課題はシアル酸の結合様式を識別するアミド化の収率向上が挙げられる。本研究室ではマイクロ波支援BEP反応を開発するにあたりマイクロ波発生有機合成装置を保有しており、本反応においてもマイクロ波の効果について検討などを行い、O-結合型糖鎖におけるSALSA法の最適化を行なっていく。またシアル酸含有糖ペプチドのエンリッチについてレクチン等の使用を計画していたが、選択的な化学修飾による回収法についての検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究を行うにあたり当初糖ペプチドのエンリッチを目的として使用を予定していたレクチンを使わずに、化学的修飾による糖ペプチドの回収を行う研究方針の変更があったため、購入する試薬が決定できなかった。今年度はビオチン導入タグなどを購入し研究を遂行する予定である。
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