| 研究課題/領域番号 |
16K05833
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
渕脇 雄介 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (80468884)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ピペット / サンドイッチ免疫アッセイ / 分析チップ / PTP / カートリッジ |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、昨年度までに構築した試薬の滴下を自動化させたピペットシステムを用いて分析チップの検出感度とバラツキについて解析を行った。さらに、実用化に向けて技術を発展させるため、サンドイッチ免疫アッセイ法をベースに蛍光法と発色法、電気化学法により検出感度の比較を行い技術的な課題の抽出に取り組んだ。その結果、酵素反応によってシグナルを増幅させる発色法が最も高感度で安定的にシグナルを検出した。ピペットシステムでは試薬の汚染を避けるため試薬を封入・保存できるカートリッジを開発した。このカートリッジはPTP（Press-Through-Pack）方式によって作製され、試薬を包装したシート状のプラスチック部分を強く押すと、試薬が外にリリースされる。１つの包装シートに対して１試薬が封入されているため保存安定性と汚染に強く、ローラでPTP包装のプラスチック部分を順番に押すと、試薬がリリースされる。実際にプロトコルが異なる４種類の検体に対して順番に試薬が添加されていくことを確認した。そこで不活化処理したインフルエンザの標品ウイルス抗原に対して、試薬と洗浄液をリリースさせてサンドイッチ免疫アッセイ法による検出を試みたところ、陽性・弱陽性・陰性に相当する感度を明瞭に検出できることがわかった。さらに酵素液を遮光して安定的に封入できるカートリッジを用いると、連続的に試薬をリリースできるだけでなく、酵素反応によるシグナルを安定的に検出することができるため感度と操作性の点で大きな進展を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は本年度、ほぼ目標どおりの成果を得た。当初は、本年度に目標として掲げた電気化学法による高感度解析が順調に進まなかったものの、シグナルを増幅・高感度化ができる試薬に分析チップの仕様をあわせることにより、酵素反応でシグナルを増幅させて目標どおりの高感度化を達成した。ただ、96 wellプレート上での解析と異なって、酵素反応を停止液で停止させてシグナルを測ることはできないため、発色し続けるシグナルを定量的に検出するための方法が十分に評価できなかった。そのため定量的な検出は、本研究目標の高感度な診断に必須な性能の一つであり、重要な項目であるため、次年度の実施項目とすることとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度までに開発したPTP包装シートによるカートリッジと分析チップを組み合わせることで、高感度多項目検出系の確立を実現する。そのため分析チップによるサンドイッチ免疫アッセイ法を行い、10分～15分で96 wellプレートによるアッセイ系と同等以上の高感度化を目指す。加えて、プロトコルの最適化に合わせた定量検出系の構築を試みる。さらにスマートフォンを使った検出として、発色を高感度に解析できる分析チップ専用のアプリの製作に取り組む。抽出処理された検体液と試薬を分析チップに滴下して、スマートフォンで直ぐに解析できる系を構築する。感度と迅速・簡便な検出について既存技術との比較を行い、特徴を明らかにする。これまで大きな課題の一つとして、プロッキング処理された溶液や界面活性剤などの洗浄液は微小流路中で再現性よく溶液交換することが難しかったが、低濃度でかつ微小流路中の容積を10μl以上になるように調整することにより改善が見られた。基板などの材料やその種類・組み合わせ、表面処理の方法、試薬と抗体濃度の条件をあわせて検討することにより、再現性の良い溶液交換が達成できるようにする。さらに、これまで実現できなかった検体の導入から検出までを１ステップで行うプロセスも確立するため、あらかじめ抗体や試薬が封入された抽出チューブ内に検体を入れておき、チューブ内で反応させた後、抗原と抗体が結合した複合体を分析チップ内に滴下する方法を試みる。これにより１ステップで検出できるプロトコルの確立を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由）当初予定していた電気化学アナライザーによる進捗より、発色法による研究進捗の方が進展したたため、消耗品の購入と研究実施計画の順番が入れ替わった。
使用計画）発色法に関わる試薬と消耗品と、カートリッジ作製用の部材を新たに購入する。また得られた成果は関連学会で発表する。
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