| 研究課題/領域番号 |
16K05836
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
藤野 智子 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (70463768)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | CuAAC / DNA / tRNA / 翻訳反応 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質・ポリペプチドへの非天然型アミノ酸導入法の開発は，医農薬をはじめ幅広い分野で注目されている．現在，非天然型アミノ酸をtRNAに人為的に連結させたアミノアシルtRNAをその運搬体として用いる手法が汎用されているが，アミノアシルtRNAの化学合成においては，効率の低さや導入可能なアミノ酸構造への制約などが克服すべき課題となっていた．本研究では，銅触媒アジドアルキン付加環化（CuAAC）反応をアミノ酸部とtRNA部の連結反応に活用することで，アミノアシルtRNAの高効率・簡便合成法を開発することを目的とする．これにより導入可能な非天然型アミノ酸を拡張し，タンパク質・ポリペプチドの自在な修飾・編集法の確立を目指す．
本研究課題を遂行するにあたり，昨年度は，鍵反応となるRNA末端のアジド化反応の開発とCuAAC連結法を開発した．本年度は，この酵素反応を用いたアジド化法の高い効率・簡便性に着目し，これをDNA末端のアジド化法へと適用した．まずDNA末端へのアジド化反応のための各種酵素をスクリーニングにより選定し，DNAの3'末端へのアジド化法を開発した．一方，アジド化オリゴヌクレオチドと連結するためのエチニル化オリゴヌクレオチドを固相合成法により新規に開発した．これまでに独自に開発してきたエチニル基をもつヌクレオシドを固相担持オリゴヌクレオチドの5'末端に伸長することでエチニル化オリゴヌクレオチドの高効率合成法を実現した．これらのアジド化オリゴヌクレオチドとエチニル化オリゴヌクレオチドとをCuAAC連結することで，多様な塩基配列・鎖長をもつ長鎖DNA合成法を確立した．得られたトリアゾール連結DNAは，複製反応の鋳型基質として機能することを見出し，PCRにより長鎖DNAの大量供給可能とした．本手法はDNAライブラリの高効率な調整法として高い波及効果が期待できる．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は，（i）DNA末端のアジド化法を開発し，（ii）これと新規に設計・合成したエチニル基を5'末端もつオリゴヌクレオチドとをCuAAC連結した．さらに（iii）得られたトリアゾール連結DNAを鋳型とした複製反応を行うことで，長鎖DNAの大量供給を可能とした．
(i) DNA 3'末端へのアジド化法：酵素反応を用いてDNAの3'末端へのアジド化法を開発した．酵素の種類や導入するヌクレオシドの塩基配列を精査し，高効率な手法を確立することができた．
(ii) エチニル基をもつオリゴヌクレオチドの合成とCuAAC連結：報告者らがこれまでに開発したエチニル基をもつヌクレオシドを活用し，これをDNA上流部に連結すべく，3'位ヒドロキシ基をホスホアミダイト化した．続いてこれを固相担持DNAの5'末端にホスホアミダイト法により連結することで，エチニル基を5'末端にもつオリゴヌクレオチドを合成した．さらに (i)にて合成したアジド化DNAとCuAAC連結するための反応条件を最適化し，高効率な連結法を開発した．
(iii) トリアゾール連結DNAを鋳型とした複製反応：モデル化合物としてトリアゾール連結部を一つ含む長鎖オリゴヌクレオチドを設計・合成した．報告者らが以前に報告した手法にならい，今回新たに設計・合成したトリアゾール連結型ジヌクレオチドを構成単位として，ホスホアミダイト法によりオリゴヌクレオチドを伸長した．これを鋳型として，非天然型連結部を乗り越え可能な酵素をスクリーニングし，最適な酵素・反応条件を決定した．本手法によりトリアゾール連結DNAを鋳型とした複製反応が可能となり，長鎖DNAの量的供給を実現できた．これらの研究成果は現在論文審査中である．
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度となる来年度は，本課題の中心分子となるtRNA合成に挑む．開発した手法を74量体からなるtRNA前駆体に適用し，5'位アルキン部をもつアミノアシルtRNA合成法を開発する．本年度開発した5'位にエチニル基をもつオリゴヌクレオチド合成法を適用し，5'位エチニル基をもつアミノアシル化ヌクレオシドを開発する．CuAAC反応による連結においては，本年度DNAを用いて反応条件の詳細を検討し，効率のよい反応条件を見出すことができたことから，迅速に遂行できると考えている．RNAに特有の分解反応などの問題が生じる場合は，本年度に得られた知見をベースとしてさらなる最適化を行う．合成するtRNAの構造については，質量分析法により決定する．これまでに長鎖RNAの分析に適した分析条件を見出しており，速やかに遂行できる予定である．さらに，トリアゾール連結型アミノアシルtRNAの翻訳反応を行い，そのアミノ酸運搬機能を評価する．リボソームや翻訳に関わる酵素を再構成した試験管内・無細胞翻訳システムを用い，そのアミノ酸運搬効率と対応するアミノ酸への選択性を指標とした評価を行う．ここではUAGコドンのmRNA内の位置を調整することで，人工アミノアシルtRNAがペプチド内に運搬する非天然型アミノ酸の導入数・導入位置・連続性などに対する構造活性相関研究により，その運搬機能を体系的に明らかにする．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は研究代表者が2月初頭から産前休暇を取得したために，試薬の購入額が予定よりも少なく，残額の繰越を行った．繰越額は次年度に物品費（主に試薬）として使用する予定である．
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