| 研究課題/領域番号 |
16K05839
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
中村 聡 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (50227899)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | GH18キチナーゼ / マルチドメイン酵素 / 触媒ドメイン / キチナーゼ挿入ドメイン / キチン結合ドメイン / プロセッシビティ |
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| 研究実績の概要 |
好アルカリ性放線菌Nocardiopsis sp. F96株のゲノム上には，互いにドメイン構成等が異なる4つのGH18キチナーゼChiF1，ChiF2，ChiF3およびChiF4がコードされている。たとえば，ChiF1はGH18触媒ドメイン（CatD）のみからなるシングルドメイン構造をとり，CatD 中にはキチナーゼ挿入ドメイン（CID）を含まない。一方で，ChiF3はマルチドメイン構造をとり，キチン結合ドメイン（ChBD），フィブロネクチンタイプⅢ様ドメイン（FnIIID）および CIDを含むGH18 CatDから構成される。これまでに，ChiF１およびChiF３の大腸菌における発現と組換えChiF1およびChiF3の性質検討を行った。さらに，ChiF1にChBD-FnIIIDまたはCID領域を付加したキメラ酵素，ならびにChiF3のCID領域を欠失した欠失型酵素の性質検討の結果，ChBD-FnIIID領域は不溶性キチンの効率的分解に寄与すること，またCIDはエキソ型の切断様式を強めることがわかった。
本年度は，ChiF2およびChiF4の発現に継続して取り組むと同時に，研究対象を好アルカリ性細菌Bacillus sp. J813株由来 GH18キチナーゼChiJにまで広げることとした。ChiJはCIDを含むGH18 CatD，FnIIIDおよびChBDから構成される。ChiJのCID領域を欠失した欠失型酵素ならびにFnIIID-ChBD領域を欠失した欠失型酵素の性質比較の結果，ChiF1/ChiF3と同様な結果が得られ，CIDおよびChBD-FnIIID（FnIIID-ChBD）領域の普遍的役割解明に迫る結果が得られた。さらに本研究の普遍性を高めるため，高度好塩性古細菌Haloarcula japonica由来GH18キチナーゼの親株における発現も実施した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
F96株由来ChiF2およびChiF4の大腸菌における発現を継続して試みたが，組換え酵素の取得には至らず断念した。
そこで，研究対象をBacillus sp. J813株由来 GH18キチナーゼChiJにまで広げ，その大腸菌における発現と性質検討を行った。さらに，ChiJのCID領域を欠失した欠失型酵素ならびにFnIIID-ChBD領域を欠失した欠失型酵素ChiJ/ΔCIDを調製し，野生型ChiJとの性質比較を行った。その結果，CID領域の欠失により，エキソ型の切断様式が弱まる傾向が見られ，そしてFnIIID-ChBD領域を欠失した欠失型酵素ChiJ/ΔFnIIID-ChBDは不溶性キチン結合能が大きく低下し，それに伴い不溶性キチン加水分解活性の大幅な減少が観察された。さらに，F96株由来ChiF1にJ813株由来ChiJのCID領域を挿入したキメラ酵素ChiF1/JCIDを調製し，野生型ChiF1との性質比較を行った。その結果，CID領域の挿入により，エキソ型の切断様式が強まる傾向が見られた。以上より，CIDはエキソ型の切断様式を強め，ChBD-FnIIID（FnIIID-ChBD）領域は不溶性キチンの効率的加水分解に寄与するという普遍的役割が推察された。
さらに，本研究の普遍性を高めるため，研究対象をさらにHa. japonica由来GH18キチナーゼChiN1およびChiN2にまで広げることとした。ChiN1およびChiN2は，いずれもChBD，機能未知ドメイン PKD，およびCIDを含むGH18 CatDから構成される。両酵素のHa. japonicaにおける発現に成功し，組換えChiN1およびChiN2がいずれも高度な耐塩性を有していることを明らかにした。
研究対象を広げたことが功を奏し，研究はおおむね順調に推移していると判断される。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに，CID はエキソ型の切断様式を強める働きがあることを示唆する結果が得られているが，明解な結果とは言い難い。先行研究によれば，CID は細菌のエキソキチナーゼに見られる構造で，基質と相互作用するクレフトを深くすることでエキソ型の切断様式を獲得すると考えられているが，プロセッシビティとの関連を含め，不明な点が多く残されているのが現状である。また，先行研究より，ChBDは不溶性キチンに結合し，その効率的加水分解に寄与することが示唆されているが，プロセッシビティとの関連については調べられていない。
今後も，F96株由来ChiF1およびChiF3，J813株由来ChiJ，およびHa. japonica由来ChiN1およびChiN2を研究対象とする。そして，主としてCIDおよびChBD領域の役割の普遍的解明を目指し，各種ドメイン欠失型酵素，キメラ酵素を調製し，それらの性質を野生型酵素と比較検討していく。これまでのキチナーゼ研究においては，エンド型／エキソ型の切断様式，不溶性キチンの効率的加水分解，そしてプロセッシビティを別々に議論してきた経緯があるが，本研究ではそれらを互いに関連づけて考察していく点でユニークと考える。また，研究対象とする酵素を増やすことで，研究の普遍性が高まるだけでなく，研究の加速も期待される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【次年度使用額が生じた理由】平成28年度からの繰越金額の影響が大きい。また，平成30年度は各種欠失型酵素やキメラ酵素の性質検討を行ってきたが，その数は限定的であった。組換え酵素の精製の自動化が可能なニッケルキレートカラム（モノリスカラムなど）の導入に至らなかったことも理由の一つである。
【使用計画】平成30年度は各種欠失型酵素やキメラ酵素の性質検討を行ってきたが，平成31年度（令和元年度）は，調製するキメラ酵素の数が激増することが予想される。当初予定していた精製の自動化が可能なニッケルキレートカラム（モノリスカラムなど）の導入を計画している。
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