新規収斂的ワンポットペプチド連結法による糖タンパク質の迅速合成と結晶構造解析

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K05844
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 岡本 亮 大阪大学, 理学研究科, 講師 (30596870)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: ワンポット / ネイティブケミカルライゲーション / タンパク質 / ペプチド / 糖タンパク質 / ピバロイルグアニジン / ピバロイルグアニジド

研究実績の概要

本年度は初年度に見出したペプチド-N-ピバロイルグアニジド(ペプチド-PivGu)体と，ペプチド連結反応であるネイティブケミカルライゲーション(NCL)を利用した，新規なワンポットペプチド連結反応の開発を行った．本検討では，合成標的である糖タンパク質，エリスロポエチン(EPO)のアミノ酸配列を利用した．166残基から成るEPOの全長ペプチド鎖は，６つのセグメント(N末端側よりseg1,2,3,4,5,6)として分割し，これらを原料としてワンポットペプチド連結反応の検討を行った．鍵物質となるペプチド-PivGu体については，申請者の確立した手法にて合成を行った(Okamoto, Chem. -Eur. J. 2017, 23, 9253.)．
まずN末端側の3セグメント(seg1,2,3)のワンポット連結反応の検討において，ペプチド-PivGuを利用した拡張型速度論的NCLの開発を行った．速度論的NCLは反応性の良いアリールチオエステルと，反応性の劣るアルキルチオエステルを併用する，既知の２セグメント位置選択的NCL反応である．これに対してさらに反応性の低いペプチド-PivGuを利用することで，３セグメントの位置選択的NCLを実現し，Seg1-Seg3に相当する67残基のペプチド-PivGuの合成に成功した．また得られたペプチドC末端のPivGu部分はチオエステルへと変換可能であり，さらなるNCLへ利用できることも確認された．
一方C末端に位置する3セグメント(seg4-6，計99残基)についても，ペプチド-PivGuを利用した効率的なワンポットNCLに成功した．以上よりタンパク質の全長を得るための新規収斂的ワンポットペプチド連結法の基盤をほぼ確立することができた．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は, 上半期で本研究の鍵となる収斂的なワンポットペプチド連結法の基盤技術を確立し，下半期で，この手法を利用したタンパク質合成の検討を開始する計画となっていた．
初年度のモデル実験での検討結果を踏まえ，上半期のはじめに，既知の光官能性保護基である4-(dimethylamino)phenacyloxycarbonyl (Mapoc)基とペプチド-PivGuを併用したワンポットペプチド連結法の検討を行った．これについて実際にEPO合成に必要なセグメントを利用して検討を行ったところ，長鎖のペプチド-PivGu体ではMapoc基除去の際の光照射条件にPivGu部分が不安定であり，再現性良くMapoc基を除去することが困難である事が明らかとなった．そこで，この問題を解決するべく新規に速度論的NCLを拡張した位置選択的ペプチド連結法を確立した．この結果，今年度の実績報告通り，タンパク質の全長を得るための新規収斂的ワンポットペプチド連結法と，これを利用したタンパク質合成について十分に目処をたてることができた．以上より本年度の検討は，計画通り順調にすすめることができており，次年度へとつながる結果が得られたものと考えている．

今後の研究の推進方策

３年目(平成３０年度)の前半期は，当初の予定通りこれまでに見出した収斂的合成法の条件の最適化と確立を目指す．本年度の研究より，全長166残基のEPO全長配列のうち，N末端67残基のペプチドとC末端側99残基のペプチドセグメントを，それぞれワンポット合成することに成功している．すでにこれらを利用した，更なるワンポット連結反応の検討を開始している．一方でこの最後のワンポット反応が困難な場合を想定し，脱塩操作などで簡易的に精製し，EPO全長鎖の構築する最後のNCLへと利用するルートも同時に検討する予定である．いずれかのルートを最適化することで，タンパク質の効率合成を可能にする，新しい収斂的ワンポットペプチド連結法の確立を目指す．続いて糖ペプチドセグメント，またはD-アミノ酸を原料とすることで，天然型の糖タンパク質EPOとEPOの鏡像異性体(D-EPO)の合成を実施する．これらは確立した新規合成手法にて簡便に行える事が予想されるため，下半期にて十分に合成が可能であると考えている．得られた，均一構造の糖タンパク質EPOおよびD-EPO を利用し，擬ラセミタンパク質結晶構造解析へと進むことを予定している．

研究成果

• [雑誌論文] Total Synthesis of O-GalNAcylated Antifreeze Glycoprotein using the Switchable Reactivity of Peptidyl-N-pivaloylguanidine (2017)
  • 著者名/発表者名: Orii Ryo、Sakamoto Noriko、Fukami Daichi、Tsuda Sakae、Izumi Masayuki、Kajihara Yasuhiro、Okamoto Ryo
  • 雑誌名: Chemistry - A European Journal 巻: 23 ページ: 9253～9257
  • DOI: 10.1002/chem.201702243
  • 査読あり
• [学会発表] ペプチドピバロイルグアニジド体を用いた新規ワンポットペプチド連結法の開発研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 花尾 卓哉、真木 勇太、梶原 康宏、岡本 亮
  • 学会等名: 日本化学会第98春季年会
• [学会発表] Total Chemical Synthesis of O-GalNAcylated Antifreeze Glycoprotein using the Switchable Reactivity of Peptidyl-N-pivaloylguanidine (2017)
  • 著者名/発表者名: Ryo Okamoto、Ryo Orii、Daichi Fukami、Sakae Tsuda、Masayuki Izumi、Yasuhiro Kajihara
  • 学会等名: 7th Chemical Protein Synthesis Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Total chemical synthesis of O-GalNAcylated antifreeze glycoprotein using the switchable reactivity of peptidyl-N-pivaloylguanidine (2017)
  • 著者名/発表者名: Ryo Okamoto
  • 学会等名: 6th Modern Solid Phase Peptide Synthesis & its Applications Symposium
  • 国際学会 / 招待講演