| 研究課題/領域番号 |
16K05861
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
松浦 俊一 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 主任研究員 (80443224)
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| 研究分担者 |
馬場 知哉 国立遺伝学研究所, 先端ゲノミクス推進センター, 特任教員 (00338196)
池田 拓史 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 主任研究員 (60371019)
山本 勝俊 北九州市立大学, 国際環境工学部, 教授 (60343042)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | DNAポリメラーゼ / メソポーラスシリカ / 固定化酵素 / DNA増幅 / 1分子PCR / ナノ空間 / 反応制御 / 多孔質材料 |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子の精密診断では、極微量DNAの増幅法の開発が求められるが、従来法では標的DNAの選択的増幅が非特異的バックグラウンド増幅により阻害される点に課題があった。本研究では、この課題解決に向け、各種ナノ空間材料へのDNA増幅酵素の固定化による反応制御技術の開発を行った。
当年度は、５種類のナノ空間材料(FSM型及びSBA型メソポーラスシリカ、メソポーラスカーボン、高Al含有メソ多孔体(C16-meso)、両親媒性有機-無機ハイブリッド多孔体(KCS-2))に固定化した等温DNA増幅反応用の鎖置換型DNAポリメラーゼ（Bst DNAポリメラーゼ）を用いてDNA増幅(LAMP法)を試みた。その結果、メソポーラスカーボンでは反応阻害の傾向が示されたが、その他の材料では陽性反応が認められた。しかし、これらの固定化酵素を繰り返し使用（２～５回）した際には、酵素を含まない反応系においても標的DNA以外の非特異的な増幅が増大したため、反応２回目以降の判定は困難であった。
当年度はまた、DNA増幅反応におけるナノ空間材料のハンドリング性の向上を図るために、メソポーラスシリカ粉末を含んだ多孔質成形体（中空糸状、ペレット状）の開発を行った。比較的親水性の高い有機高分子をバインダーとして適宜の形状に成形した結果、メソポーラスシリカ本来の細孔構造を維持した状態で成形体化することに成功した。
以上の結果より、LAMP法においてはバックグラウンドDNA増幅の影響が大きいものの、シリカ細孔及びKCS-2の両親媒性のナノ空間が酵素の安定な固定化場および反応場となり得る可能性が示唆された。また、メソポーラスシリカ粉末の成形手法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当年度は、酵素の固定化支持体として用いるメソポーラスシリカ粉末を含んだ多孔質成形体（中空糸状、ペレット状）の開発に多くの時間を要したため、当初計画していた全ての実験項目について検討することはできなかった。等温DNA増幅反応（LAMP法）用のDNA増幅酵素（Bst）を対象にした反応評価では、バックグラウンドDNA増幅の影響が大きいものの、シリカ細孔及びKCS-2の両親媒性のナノ空間が酵素の安定な固定化場および反応場となり得る可能性が示唆された。
以上のことより、当初の計画にはなかった新規の固定化担体（メソポーラスシリカ粉末を含んだ多孔質成形体）の開発も踏まえて次年度の展開を検討していく計画である。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、当年度に実施できなかった実験項目を含め、交付申請書に記載の平成３０年度以降の実施計画に沿って研究を推進する。
具体的な推進方策としては、当年度に得られたLAMP法での研究成果を基に、当年度に新たに開発した固定化担体（メソポーラスシリカ粉末を含んだ多孔質成形体）へのBst DNAポリメラーゼの固定化状態の評価について検証する。
また、ここで得られたDNAポリメラーゼ－多孔質成形体をLAMP法に適用し、１分子レベルの極微量DNAからの増幅反応を実現可能にするためのナノ空間材料の表面組成等の最適化を図る。
さらに、固体NMR等の分光学的手法を活用して、支持体として用いるナノ空間材料の細孔表面の緩衝液等による変化を明らかにし、DNA増幅反応に好適な固定化条件を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）当年度は、等温DNA増幅反応用の鎖置換型DNAポリメラーゼ（Bst DNAポリメラーゼ）など試薬類（消耗費）について研究費の大半を充当する予定であったが、当初計画していなかった、メソポーラスシリカ粉末を含んだ多孔質成形体（中空糸状、ペレット状）の開発に多くの時間を費やすことになったため、DNA増幅反応の評価に必要な試薬・消耗品の購入を必要最低限に留めた。また、当初計画で予定されていた環境微生物からのゲノムDNAの抽出操作および反応解析に着手できず、これらを実施するための研究分担金の未使用分が生じた。
（使用計画）現段階では、メソポーラスシリカを初めとするナノ空間材料やその成形体の準備が整っており、次年度は主に、等温DNA増幅反応用の鎖置換型DNAポリメラーゼ（Bst DNAポリメラーゼ）やゲノムDNAの抽出に関わる試薬等の消耗品費に充当する計画である。また、これまでに得られた知見をまとめ、研究成果の発表（学術論文および学会発表）を行うための論文投稿費、学会登録費、国内旅費等に研究費を充てる予定である。
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