| 研究課題/領域番号 |
16K05917
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
櫻井 敏彦 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (10332868)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ペプチド核酸 / 遺伝子発現制御 / KRAS遺伝子変異 / SNP / がん治療 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度の研究成果（サイトゾルリリースシグナルを配したペプチド核酸(PNA) -ポリエチレングリコール (PEG) コンジュゲート (i-PPC) による細胞内遺伝子発現制御）をもとに，この基本構造を持ちかつカーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（KRAS）遺伝子1塩基変異を認識するPNA塩基配列を決定した。さらに，得られたi-PPCによるKRAS遺伝子変異性がん細胞の誘導死を検討した結果，遺伝子変異に対応した細胞死が誘導された。
KRAS遺伝子WTのがん細胞（ヒト膵臓腺癌由来がん細胞BxPC-3細胞）とKRAS遺伝子変異性がん細胞（ヒト膵臓腺癌由来がん細胞PANC-1細胞）を対象としたKRAS遺伝子1塩基変異を認識するi-PPCを16種類合成し，synDNAとの相補鎖形成挙動を検討した。この結果、16種類のうち2種類のi-PPCにおいてフルマッチとミスマッチ配列に対して融解温度に顕著な差が見られたことから，このPNA配列を採用したシグナルペプチド化i-PPC (i-PPC(tag)_KRAS_FMとi-PPC(tag)_KRAS_MM)を合成した。このシグナル化i-PPCを所定濃度（10, 1, 0.1, 0.01 mM）BxPC-3細胞の培養液に加えたところ，i-PPC(tag)_KRAS_FMの10Mにおいて優位な細胞死が観測されたことから，遺伝子配列特異的に細胞死を誘導していることが示された。一方でPANK-1細胞では，i-PPC(tag)_KRAS_FMとi-PPC(tag)_KRAS_MMの10mMいずれにおいても細胞死が誘導され，特にi-PPC(tag)_KRAS_FMにおいて顕著であった。この結果より，PANC-1細胞に対しては遺伝子配列特異的に細胞死を誘導しないことが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
KRAS遺伝子1塩基変異の中でも特に変異率の高いコドン12の変異（ggt→gat）をターゲットとしたPNA塩基配列を決定した。ルシフェラーゼを対象としたときの変異認識よりは劣るが，融解温度の差は生体温度をまたぐ範囲に設定できた．次に，膵臓がん細胞を培養してサイトゾルリリースシグナルペプチドを配したi-PPCを添加したところ，i-PPC(tag)_KRAS_FMでは対象とするBxPC-3細胞に対してのみ細胞死を誘導できることが示された。一方で，i-PPC(tag)_KRAS_MMでは対象とするPANC-1細胞だけでなく、BxPC-3細胞に対しても細胞死を誘導した。この原因については現在未解決であるが、他遺伝子へのオフターゲット効果が疑われた。この他、細胞誘導死の評価におけるがん細胞の3次元組織化の必要性が示唆された。今後はこれらの問題を検討すると共に、当初の予定でもあった，がん細胞へのターゲッティングでもある抗体とのコンジュゲートについて作製する予定である。
以上、KRAS遺伝子をターゲットとしたi-PPCの合成と相補鎖形成挙動を検討できたこと（当初の計画通り），サイトゾルにリリース可能なi-PPCによる変異性がん細胞の誘導死が確認できたこと（当初の計画通り）から、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
【今後の研究の推進方策 等】
i-PPC(tag)_KRAS_FMでは対象とするBxPC-3細胞に対してのみ細胞死を誘導できることが示されたものの，i-PPC(tag)_KRAS_MMでは対象とするPANC-1細胞だけでなく、BxPC-3細胞に対しても細胞死を誘導した。この原因について、下記の点について検討する。
a)他遺伝子へのオフターゲット効果が
b)細胞誘導死の評価におけるがん細胞の3次元組織化
今後はこれらの問題を検討すると共に、当初の予定でもあった，がん細胞へのターゲッティングでもある抗体とのコンジュゲートについて作製する予定である。
c)i-PPC－抗EGFR抗体薬の複合化：有機化学的な手法（ジスルフィド結合，アミド結合など）によるi-PPCと抗EGFR抗体薬の複合化を行い，がん細胞へのターゲティングトランスフェクトについて検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
端数金額のため、９９３円の残金が生じた。翌年度に、消耗品費用として使用する計画である。
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