| 研究課題/領域番号 |
16K06874
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
河邉 佳典 九州大学, 工学研究院, 助教 (30448401)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ゲノム操作 / CRISPR / トランスジェニック鳥類 / ニワトリ多能性幹細胞 / ニワトリ胚 / 初期化 / ゲノム編集 / 卵白タンパク質遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、主として以下の３つに関連する研究を行った。
１）卵白タンパク質遺伝子座におけるゲノム編集：卵白タンパク質遺伝子座で設計した複数のsgRNAをニワトリ初代細胞および細胞株において評価した。遺伝子導入後、ゲノムDNAを抽出し、T7EIアッセイを行ったところ、セレクションなしで30％以上のIndel値を示したことから、ゲノム編集の候補となる編集部位を同定することができた。ノックイン用ドナーベクターの構築が完成しており、現在ノックイン効率を評価しているところである。
２）胚への遺伝子導入：ゲノム編集ベクターの胚への遺伝子導入にあたり、レポーター遺伝子（LacZ）をニワトリ初期胚へマイクロインジェクションした。導入条件をさらに最適化する必要はあるものの、導入部位においてレポーター遺伝子（β-gal）の発現が認められた。今後上記で検討したsgRNAを胚へ導入することで、ゲノム編集効率の評価を行う予定である。
３）ニワトリ多能性幹細胞樹立に関する研究：網羅的遺伝子発現解析により得られた複数の転写因子のニワトリホモログを自己切断型2Aペプチドを介して共発現できるように人工遺伝子合成した。これらの遺伝子をトランスポゾンベクターに組込み、ニワトリ体細胞への遺伝子導入実験を行った。ベクターにおける目的遺伝子サイズが増えたため、遺伝子導入条件をさらに検討する必要があるものの、ニワトリ細胞への遺伝子導入が確認できたことから、今後初期化誘導実験を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ニワトリ初代培養細胞ならびに体細胞株ともに卵白タンパク質遺伝子座において非選択圧下で高い効率で編集可能なガイドRNAを見いだすことができた。目的遺伝子を有するノックインベクターの作製も終えており、高い編集効率ならびに遺伝子ノックインが期待できると考えている。ニワトリ初期胚への目的遺伝子導入実験では、導入遺伝子の発現が認められ、胚レベルにおけるゲノム編集導入実験への足がかりを構築することができた。ニワトリ多能性幹細胞樹立にむけた検討では、既知転写因子ファミリーのニワトリホモログを人工遺伝子合成し、複数の遺伝子を共発現可能な発現ユニットとして目的ベクターへと組込んだ。ニワトリ細胞への遺伝子導入もできたことから、今後誘導実験を推進させる予定である。これらの成果の一部を複数の学会に報告した、または報告予定である。本年度は概ね研究計画書に基づいて進展できたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請書の実験計画に基づいて、以下の検討項目課題の実施を予定している。
・ニワトリ体細胞の卵白タンパク質遺伝子座におけるベクター別ノックイン効率と導入遺伝子構造解析等
・導入遺伝子の発現解析等
・遺伝子導入条件に基づくニワトリ初期胚におけるダイレクトゲノムマニピュレーション実験等
・ニワトリ細胞の初期化誘導等
・様々なゲノムマニピュレーションサイトへの応用展開等
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
レトロウイルスベクター法での遺伝子導入の検討割合を減らしたため。高力価レトロウイルスベクターを調製する際、高価な細胞への遺伝子導入試薬を多く使用する必要がある。他のベクターによる遺伝子導入の検討を進めることで見込み額を倹約できたので、最終年度へ回すこととした。
（使用計画）
最終年度は、細胞培養や、構築したベクターの遺伝子導入と胚操作における条件検討、ゲノム構造解析等を中心に実施を計画している。そのため、遺伝子工学およびタンパク質工学関連試薬、培養培地・血清や実験動物(有精卵)の購入のため、消耗品費を多く当てる予定である。旅費は関連学会における成果発表と情報収集のために使用し、謝金は英文校閲費のために使用する予定である。
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