| 研究課題/領域番号 |
16K06875
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| 研究機関 | 北九州市立大学 |
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研究代表者 |
中澤 浩二 北九州市立大学, 国際環境工学部, 教授 (00304733)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / 胚様体 / マイクロウェルチップ / 低酸素 / 分化 / Wntシグナル |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、独自に開発したマイクロウェルチップ培養を利用して、iPS胚様体（球状細胞組織体）を取り巻く微小培養環境と細胞分化特性の関係性を明らかにすることを目的としている。昨年度の研究において、酸素供給環境の違いによってiPS胚様体の分化スイッチング現象が起こることを明らかにしたことから、本年度は胚様体内部の酸素化状態と分化特性の解析および分化スイッチングに関与するシグナル系の探索を行った。
まず、独自に設計・作製したポリメチルメタクリレート（PMMA）製チップとポリジメリルシロキサン（PDMS）製チップにおいて、微小酸素電極を利用して培養系内の酸素濃度変化を実測した。その結果、PDMSチップはPMMAチップに比べ、培養系内への酸素供給能が約15倍高いことがわかった。
次に、低酸素蛍光プローブを用いて酸素供給能の異なる両チップにおけるiPS胚様体内部の酸素化状態を評価した結果、PMMAチップでは胚様体中心部（体積比にして約25%の領域）において低酸素環境が発生したのに対し、PDMSチップでは培養7日目でも低酸素環境の発生はほとんど見なれなかった。さらに、蛍光プローブを用いて未分化状態を評価した結果、胚様体内部に未分化細胞集団が多く存在することが示された。これらの結果から、iPS細胞の分化は胚様体周辺部から進行し、低酸素環境が発生する胚様体内部では未分化状態が維持されやすい傾向にあることが示唆された。
酸素供給能の異なる両チップにおいて、iPS細胞が分化スイッチングを起こす細胞内シグナル経路を探索した。様々なシグナル因子のなかで、細胞が自己分泌するタンパク質であるWnt5aの発現に変動がみられ、そのシグナル伝達の下流に位置する細胞内酵素であるAKT1の作用が血管系細胞と肝細胞への分化を調節している可能性を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の目標は、（１）ガス透過性チップを用いたiPS胚様体の分化特性の評価、（２）胚様体内部の分化状態と酸素環境の関係性、（３）ヒトiPS細胞を利用した分化スイッチング現象の評価であった。
（１）については、当初、酸素供給能を変化させたPDMSチップを作製し、胚様体の分化特性の変化を評価することを計画していたが、次年度に計画していた「酸素応答による分化スイッチングのメカニズム解析」の取り組みが科学的インパクト性が高く、早急に取り組むべきと考え、実験計画を前後させた。「メカニズム解析」を優先し、その一端が明らかになったことは大きな成果である。また、当初計画していた（１）は来年度に引き続き実施する。
（２）については計画通りに実施でき、胚様体中心部に低酸素環境が発生するとともに、その領域は未分化能が維持される傾向にあることを見出した。さらに、胚様体周辺部から細胞の分化が進行することを明らかにした。
（３）については予備検討を実施した。マイクロウェルチップ培養によるヒトiPS細胞の胚様体形成は確認できた。しかしながら、ヒトiPS細胞はマウスiPS細胞に比べて胚様体形態の安定的な維持が難しいことから、現在、培養培地や添加マトリクス条件の最適化を実施している。
本年度の実施計画には多少の変更があったが、全体計画からみれば予定通りに進行しており、本研究目標の第２段階をクリアした。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度は、iPS胚様体を取り巻く微小酸素環境と細胞分化の関係性を詳細に検討すべく、以下の三つの検討を実施する。
（１）ガス透過性チップを用いたiPS胚様体の分化特性の評価：培養系内への酸素供給能を変化できるチップを作製し、酸素供給量と細胞分化特性の関係を明らかにすることによって、分化スイッチングが起こる境界条件を明らかにする。
（２）分化スイッチングメカニズムの解析：酸素環境によってWnt5aシグナル経路が活性化されることを見出したことから、その下流シグナル経路を解析し、分化スイッチングに関与する全体経路を探る。
（３）ヒトiPS胚様体の分化スイッチング現象の評価：マイクロウェルチップを用いたヒトiPS胚様体の安定培養条件を確立後、ヒトiPS胚様体においてもマウスiPS細胞と同様な分化スイッチング現象が起こるかどうかを評価する。
以上の取り組みをもとに、iPS胚様体を取り巻く微小酸素環境と細胞分化の関係性について総括する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画では、平成29年度に「酸素供給能を変化させたマイクロウェルチップによる胚様体の分化特性の評価」、平成30年度に「酸素応答による分化スイッチングのメカニズム解析」を予定していたが、後者の方が科学的インパクト性が高く、早急に取り組むべきと考え、実験計画を前後させた。
ここで、前者の実験は後者に比べて多くの培養実験が必要であることから、物品費（チップ材料や培養試薬・培養基材など）が多くかかる。今回、実験計画を前後させたことにより、平成29年度の物品費が抑えられたが、平成30年度は前者の実験を実施することから、繰越金は物品費に当て有効利用する予定である。
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