オプトジェネティクスを用いた新生児ラット呼吸中枢の解析

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K07003
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 鬼丸 洋 昭和大学, 医学部, 客員教授 (30177258)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: Phox2b / 呼吸リズム / トランスジェニックラット / オプトジェネティクス / チャネルロドプシン

研究実績の概要

Phox2b_tTA-2A-Cre Rec BAC トランスジェニックラット（①）とRosa26::floxed STOP-ChRFR(C167A)-Venus #1, #2 トランスジェニックラット（③）の掛け合わせによって生まれてくる新生児ラットから，チャネルロドプシンを発現しているものを選び実験を行った． チャネルロドプシン発現陽性新生児ラットから，脳幹-脊髄標本を作製し，第４頸髄前根（C4）から吸息性活動をモニターし，吻側腹外側延髄に青色LED光を照射し，呼吸リズムの変化を調べた．さらにこの領域の呼吸性ニューロンから細胞内電位を記録し，光照射刺激の効果を調べた．呼吸リズムは，青色LED光の照射（50ms パルス幅，150ms インターバル，5-60s ）によって，3倍以上まで促進した．さらに吻側腹外側延髄に光刺激（0.5-1s）を行うことによって，呼吸リズムがリセットされた．チャネルロドプシンを発現している（つまりPhox2b陽性）Pre-Iニューロン(n=9)は，光刺激に応答して約10mVの脱分極を示した．チャネルロドプシン陰性（つまりPhox2b陰性）のPre-Iニューロン(n=7)も約5mVの脱分極を示した．一方，チャネルロドプシンを発現している吸息性ニューロン(n=5)は光刺激に応答して7.3mVの脱分極を示し，陰性の吸息性ニューロン(n=6)は有意な脱分極を示さなかった．さらにTTX存在下で，チャネルロドプシン発現ニューロン(n=8)は，光刺激に応答して約8mVの脱分極を示したが，チャネルロドプシン陰性ニューロン(n=3)は，有意な膜電位変化を示さなかった．これらの結果は，Phox2b陽性細胞から呼吸性ニューロンへの興奮性入力は，まずPre-Iニューロンにおいて統合され，その活動により吸息性バーストが周期的にトリガーされることを示唆する．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

チャネルロドプシン発現ラットの新生児摘出脳幹‐脊髄標本を用いた研究では，ほぼ必要なデータがそろったと思われる．ただ，チャネルロドプシン陰性ニューロンの細胞内記録の例数を少し増やす必要がある．

今後の研究の推進方策

今後は，論文としてまとめるにあったって，若干不足している細胞内記録のデータを取り，解析を進める予定である．

次年度使用額が生じた理由

（理由）３月末の高松での生理学会旅費などが含まれていないため．

（使用計画）支払い可能になった時点で，速やかに清算する予定である．

研究成果

• [雑誌論文] Targeted expression of step-function opsins in transgenic rats for optogenetic studies. (2018)
  • 著者名/発表者名: Igarashi H, Ikeda K, Onimaru H, Kaneko R, Koizumi K, Beppu K, Nishizawa K, Takahashi Y, Kato F, Matsui K, Kobayashi K, Yanagawa Y, Muramatsu SI, Ishizuka T, Yawo H.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 8 ページ: 5435
  • DOI: 10.1038/s41598-018-23810-8.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Confocal calcium imaging analysis of respiratory-related burst activity in the parafacial region. (2018)
  • 著者名/発表者名: Onimaru H, Nakamura S, Ikeda K, Kawakami K, Inoue T.
  • 雑誌名: Brain Res Bull. 巻: 139 ページ: 16-20
  • DOI: 0.1016/j.brainresbull.2018.01.013.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Erythropoietin, a putative neurotransmitter during hypoxia, is produced in RVLM neurons and activates them in neonatal Wistar rats. (2018)
  • 著者名/発表者名: Oshima N, Onimaru H, Yamagata A, Itoh S, Matsubara H, Imakiire T, Nishida Y, Kumagai H.
  • 雑誌名: Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1152/ajpregu.00455.2017
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effects of eugenol on respiratory burst generation in newborn rat brainstem-spinal cord preparations. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kotani S, Irie S, Izumizaki M, Onimaru H.
  • 雑誌名: Pflugers Arch. 巻: 470 ページ: 385-394
  • DOI: 10.1007/s00424-017-2074-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of riluzole on spinal seizure-like activity in the brainstem-spinal cord preparation of newborn rat. (2017)
  • 著者名/発表者名: Lin ST, Ohbayashi M, Yamamoto T, Onimaru H, Kogo M.
  • 雑誌名: Neurosci Res. 巻: 125 ページ: 46-53
  • DOI: 10.1016/j.neures.2017.07.002
  • 査読あり
• [雑誌論文] An in vitro experimental model for analysis of central control of sympathetic nerve activity. (2017)
  • 著者名/発表者名: Oyama Y, Iigaya K, Minoura Y, Okabe T, Izumizaki M, Onimaru H.
  • 雑誌名: J Physiol Sci. 巻: 67 ページ: 629-635
  • DOI: 10.1007/s12576-017-0549-5.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Distinctive features of Phox2b-expressing neurons in the rat reticular formation dorsal to the trigeminal motor nucleus. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nagoya K, Nakamura S, Ikeda K, Onimaru H, Yoshida A, Nakayama K, Mochizuki A, Kiyomoto M, Sato F, Kawakami K, Takahashi K, Inoue T.
  • 雑誌名: Neuroscience 巻: 358 ページ: 211-226
  • DOI: org/10.1016/j.neuroscience.2017.06.035
  • 査読あり
• [雑誌論文] Knockout of sodium pump α3 subunit gene (Atp1a3-/-) results in perinatal seizure and defective respiratory rhythm generation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ikeda K, Onimaru H, Kawakami K.
  • 雑誌名: Brain Res. 巻: 1666 ページ: 27-37
  • DOI: 10.1016/j.brainres.2017.04.014.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct effects of glucose, insulin, GLP-1, and GIP on bulbospinal neurons in the rostral ventrolateral medulla in neonatal wistar rats. (2017)
  • 著者名/発表者名: Oshima N, Onimaru H, Matsubara H, Uchida T, Watanabe A, Imakiire T, Nishida Y, Kumagai H.
  • 雑誌名: Neuroscience 巻: 344 ページ: 74-88
  • DOI: 10.1016/j.neuroscience.2016.12.039.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Interaction between novel oscillation within the ventromedial hypothalamus and the sympathetic nervous system (2017)
  • 著者名/発表者名: Kamon Iigayaa, Shuntaro Okazaki, Yoshino Minoura, Hiroshi Onimaru,
  • 雑誌名: Neuroscience 巻: 343 ページ: 213-221
  • DOI: org/10.1016/j.neuroscience.2016.11.048
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of a TRPV1 agonist capsaicin on respiratory rhythm generation in brainstem-spinal cord preparation from newborn rats. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tani M, Kotani S, Hayakawa C, Lin ST, Irie S, Ikeda K, Kawakami K, Onimaru H.
  • 雑誌名: Pflugers Arch. 巻: 469 ページ: 327-338
  • DOI: 10.1007/s00424-016-1912-8.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The respiratory control mechanisms in the brainstem and spinal cord: integrative views of the neuroanatomy and neurophysiology. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ikeda K, Kawakami K, Onimaru H, Okada Y, Yokota S, Koshiya N, Oku Y, Iizuka M, Koizumi H.
  • 雑誌名: J Physiol Sci. 巻: 67 ページ: 45-62
  • DOI: 10.1007/s12576-016-0475-y
  • 査読あり
• [学会発表] Respiratory rhythm generation under the reduced mutual excitatory synaptic connections (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Onimaru, Sayumi Kotani, Saki Yagura, Shih Tien Lin, Masahiko Izumizaki
  • 学会等名: 第94回日本生理学会大会高松
• [学会発表] Angiotensin II enhanced peripheral sympathetic nerve activity in the brainstem-spinal cord preparation from newborn rats (2017)
  • 著者名/発表者名: Y. Oyama, H. Onimaru, K. Iigaya, Y. Minoura
  • 学会等名: ISAN2017
  • 国際学会
• [学会発表] Relationship between the distribution of the paired-like homeobox gene (Phox2b) expressing cells and blood vessels in the parafacial region of the ventral medulla of neonatal rats. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Onimaru
  • 学会等名: IUPS 38th World Congress, Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Optognetic analysis of medullary respiratory center by modulating activity of Phox2b expressing cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Onimaru, Keiko Ikeda, Hiroyuki Igarashi, Hiromu Yawo, Masaaki Ogawa, Kan-ichiro Ihara, Kazuto Kobayashi, Satoru Arata, Kiyoshi Kawakami
  • 学会等名: IUPS 38th World Congress, Abstract 07.001
  • 国際学会
• [学会発表] Optognetic analysis of neuronal network of medullary respiratory center in transgenic rats expressing channelrhodopsin in Phox2b expressing cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Onimaru, Keiko Ikeda, Hiroyuki Igarashi, Hiromu Yawo, Kazuto Kobayashi, Kiyoshi Kawakami
  • 学会等名: 第40回日本神経科学会, 幕張メッセ