| 研究課題/領域番号 |
16K07006
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| 研究機関 | 同志社大学 |
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研究代表者 |
御園生 裕明 同志社大学, 脳科学研究科, 教授 (40609509)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / 軸索 / 活動電位 / 興奮 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、我々が独自に見い出した、新しい軸索内Ca2+シグナリングとその生理的役割について明らかにすることを目的としている。特に、ランビエ絞輪近傍に発現するCa2+依存性K+チャネル（BKチャネル）と、その活性化に必要なCa2+を供給する電位依存性Ca2+チャネルの同定を行ってきた。今年度までに、ニッケルに感受性のあるT型Ca2+チャネルが発現することを示唆する結果を得、オーストリアISTの重本博士との共同研究により、BKチャネルと電位依存性Ca2+チャネルの共局在を検討するための手法として、凍結割断レプリカを免疫染色して、軸索上 のCa2+チャネルを高感度かつ定量的に検出し、また電子顕微鏡の高い解像度でその局在を決定できる手法の開発を進めてきた。本年度は、さらにCa2+チャネルの同定をすすめ、Cav3.2がその実態である可能性を示唆する結果を得た。また、ランビエ絞輪の凍結割断レプリカ上での検出が困難であることが予想されたため、包埋前免疫染色法による検出も並行して行った。軸索モデルの構築も継続して続けている。未だチャネル密度が計測できていないので、細かなパラメータが決定できていないが、形態や基本的な膜特性のモデル構築についてはできつつある。 BKチャネルの局在化を研究する上では、遺伝子導入の可能な実験系が必要であるため、小脳スライス培養の導入を検討したが、ミエリン化に必要なグリア細胞の制御が非常に難しかったため、分散培養の系を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、研究計画として、
(1)有髄軸索におけるイオンチャネルの密度を計測し、Ca2+依存性K+チャネルによる軸索内活動電位制御シミュレーションを構築する。
(2)BKチャネルをランビエ絞輪付近に局在化するメカニズムの探索する。
(3)軸索BKチャネルを特異的に阻害するマウスの作成と解析を行う。
の3つを提案した。現在のところ、(1)のイオンチャネルの密度計測の方法論の確立とシミュレーションの構築および(2)のBKチャネル局在化メカニズムの探索を進めている。本年度は、オーストリアISTとの国際共同研究によって、電位依存性Ca2+チャネルの同定を行うことができた。また、密度計測の手法として、凍結割断レプリカ免疫染色法のみでなく、包埋前免疫染色法を導入することもできている。これらにより(1)の達成に道が開かれたと考えている。また、(2)についても、これまでにほとんど研究されていないランビエ絞輪へのイオンチャネル局在化メカニズムを探求するための実験系を確立しつつあり、(3)を達成するためにメカニズムの探求を進めていう予定である。これらより、目的達成に向けて確実に前進しており、研究計画は概ね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
軸索モデルの構築を行う場合には、軸索から実際に電気生理学記録を行い、モデルの妥当性を検証する必要がある。前年度から引き続き、軸索断端 （axon bleb）からの記録を試みているが、ミエリン化が完成しているような週齢のマウス小脳切片からの記録は難易度が非常に高く、安定した記録法の確立には至っていない。そこで、我々がこれまでに確立している、細胞体からの逆行性活動電位の記録も並行して行っている。これらの手法により、これまで殆ど知られていない、軸索の電気的特性を知り、軸索内活動電位のCa2+依存性制御メカニズムとその役割を検証できるようになると考えている。また最近、分散神経細胞培養系で、グリア細胞との共培養によりミエリン化を再現できる系が報告されている。これをBKチャネル局在化メカニズムの研究に応用すべく、実験系を確立中である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
基金であり、生じたのが極小の端数であったため、次年度に持ち越すこととした。
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