| 研究課題/領域番号 |
16K07011
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| 研究機関 | 中部大学 |
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研究代表者 |
畠中 由美子 中部大学, 生命健康科学部, 研究員 (40271548)
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| 研究期間 (年度) |
2016-10-21 – 2020-03-31
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| キーワード | 大脳皮質形成 / 発生・形態形成 / 細胞系譜 / 神経細胞分化 / ニューロンサブタイプ |
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| 研究実績の概要 |
多様性に富む大脳皮質興奮性ニューロンは、いずれも皮質脳室帯の神経幹細胞から生じる。この時、幹細胞から直接ニューロンに分化する経路と、中間神経前駆細胞を経てニューロンに分化する経路が知られている。昨年度は、これらニューロンの産生過程を調べるために、薬剤（タモキシフェン）誘導型のCreを持つドライバーマウスとレポーターマウスの交配・薬剤投与条件を検討し、神経幹細胞、並びに中間神経前駆細胞由来ニューロンの蛍光標識法をそれぞれ確立した。本年度はこのうち、中間神経前駆細胞由来ニューロンに焦点を当て、派生するニューロン間の関係性を明らかにすることを目的とした。標識数日後における解析では、１つの中間神経前駆細胞からは主に２つのニューロンが生じ、これらは初期投射や分子発現を共有していることがわかった。さらに分化が進んだ神経細胞の性質を調べるため、生後３週齢マウスにおける標識ニューロンの層内分布や細胞体・樹状突起形態解析することを試みた。この時、妊娠中の薬剤投与により多くの親マウスが正常分娩ができず、標識マウスは帝王切開で回収した。３次元的な形態解析を行うためには厚い脳スライスを用いるのが好ましいが、そのままの状態では蛍光が微弱であること、並びに組織の厚みのために深部まで観察することが難しかった。そこで、まず300-500 マイクロメーター厚の固定脳スライスに段階的メタノール処理で脱脂を施し適度な細孔を作成した。その結果、抗体が内部にまで浸透することが可能になり、蛍光標識の増感に成功した。さらにCUBIC法を参考とした透明化法の適応により、３次元的な画像取得が可能になり、形態解析の準備を整えることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
抗体染色と透明化法が軌道に乗ったのは大きな進展であったが、代表者が所属機関を移動したことに伴い実験で使用するマウスの移動手続きが必要となった。このため、しばらく実験サンプルを得ることができない期間があった。また、昨年度にはマウスの感染事故ですでに進捗に遅れが出ており、それを挽回するに至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度までの成果により、神経幹細胞由来のニューロンを標識しその形態を観察する方法については条件設定がほぼ終了した。特に、幹細胞から中間神経前駆細胞を経て分化するニューロンの解析が進んでいるので、まずはこの例数を増やしてまとめる。その後、幹細胞から由来するニューロン全体について、当初の計画であるタイムラプスイメージングを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
所属機関の移動により動物実験に遅れが出て、これに関わる消耗品を繰越すこととなった。そこで３０年度は、当初の計画実験とともに遅延した動物実験も行い、その費用と合わせて使用することとした。
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