| 研究課題/領域番号 |
16K07017
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
大西 哲生 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 副チームリーダー (80373281)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 転写因子 / 統合失調症 / クロマチン免疫沈降 / 均衡型転座 / 双極性障害 |
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| 研究実績の概要 |
de novoの均衡型染色体転座を伴う統合失調症症例のゲノム解析を行い、4番染色体切断点近傍にある遺伝子として同定したLDB2 (Lim Domain Binding 2)の転写調節因子としての機能解析、及び精神疾患において発見したLDB2およびLDB2相互作用分子の点変異の生物学的評価を行うことで、LDBネットワークと精神疾患の関わりを探るのが本研究の主題である。LDB2はファミリータンパクのLDB1と同様、DNA結合ドメインは持たないものの各種転写関連因子と結合することで、下流遺伝子の発現を調節する機能を果たすと予測されたが、我々の研究以前には詳しい解析はほとんどなされてこなかった。研究期間開始前までに、LDB2 KOマウスに統合失調症様行動変化が現れること、野生型マウスと比較して、KOマウス脳では様々な遺伝子の発現変動が見られることを明らかにしてきた。本年度は、HEK293T細胞を用いた強制高発現系において免疫沈降を行うことにより、ファミリータンパク質であるLDB1同様、LDB2がLHXファミリー、SSBPファミリー、LMOファミリー、RLIMと複合体を形成する事が判明した。また双極性障害患者から発見したRLIM S455F変異は、LDB2との結合に影響は与えないことが明らかになった。また双極性障害患者から同定した２つのLDB2点変異（T83N, P170L)に関して、上記タンパク質群との相互作用、およびLDB2の二量体化への影響を詳しく検討したが、明瞭な影響は観察されなかった。29年度には、LDB2が結合するゲノム領域を同定するためにChIP-Seq法を試みるが、その前段階として各種組織、細胞においてLDB2の免疫沈降実験を行い、自作LDB2ポリクローナル抗体によりLDB2-DNA複合体を効率よく濃縮できる条件を確立することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
免疫沈降実験により、LDB2の複合体形成能を明らかにするとともに、LDB2の点変異、RLIMの点変異は複合体形成能に直接影響を与えないことを明らかにできたため。また次年度での本格的な解析に向け、ChIP-Seqの条件を樹立することに成功したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
LDB2転写調節複合体がどの遺伝子の発現を直接制御するのかを明らかにするため、ChIP-Seq実験を行う。前年度までに自作LDB2ポリクローナル抗体が効率よくLDB2-DNA複合体を濃縮できることを明らかにしている。免疫沈降のソースとして扱いが容易でタンパク質-DNA複合体の調製法が確立している培養細胞と、すでにマイクロアレイのデータを取得しているマウス脳組織を考えている。培養細胞に関しては、正常対照者から樹立したヒトiPS細胞とそこから分化誘導した神経系細胞を用いる。すでに未分化iPS細胞からニューロスフィア（神経幹細胞がenrichされている）への分化誘導により、内在性LDB2の発現が大きく増大することを明らかにしており、まずはこの細胞を使ってChIP-Seq解析を行う。つぎに、技術的な困難を伴うと予想されるが、マウス脳組織（前頭葉、海馬）サンプルからChIPできる条件の確立を行い、それが終了次第、ChIP-Seq解析を行う。データ解析により、LDB2転写複合体が結合する領域をゲノム上にマッピングし、それぞれの部位がどの遺伝子あるいはその近傍にあるのかを明らかにする。その結果を、すでに得ているLdb2 KOマウス脳のマイクロアレイ実験の結果と照合し、LDB2転写調節複合体がどの遺伝子の発現を直接制御し得るのかを解析する。機能的に統合失調症やKOマウスの表現型に関連しうる遺伝子群をリストアップし、特に注目されるものに関してはトランスフェクション系によるレポーターアッセイにより、LDB2による該当遺伝子の発現調節能を分子生物学的に証明する。またChIP-Seqで検出された領域に、どのような既知転写因子のbinding motifが濃縮しているのかを解析する。Lhxファミリーに加えて、LDBファミリーとの関連が知られていなかった転写因子を同定できる可能性も高いと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
強制発現系で明らかにしたLDB2結合タンパク質に関して、内在性タンパク質間の相互作用をマウス脳組織、iPS細胞から誘導したニューロスフィアを用いて調べる予定であったが、良好な特異性を示す抗体の選択に時間がかかっており、平成29年度に実験することにしたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
マウス脳組織やニューロスフィアから内在性LDB2複合体を免疫沈降し、その複合体中に相互作用候補分子が存在していることをウエスタンブロット法で証明する、次年度使用額は、主にこの解析のための特異抗体を購入する予定である。
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