神経難病那須ハコラ病の脳分子病態解明に関する基礎的研究

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K07043
• 研究機関: 明治薬科大学
• 研究代表者: 佐藤 準一 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (30274591)
• 研究分担者: 紀 嘉浩 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (80415140)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 那須・ハコラ病 / 白質脳症 / ミクログリア / DAP12 / TREM2 / アルツハイマー病 / 遺伝子診断 / 免疫組織化学

研究実績の概要

【概要】那須・ハコラ病(Nasu-Hakola disease; NHD)は多発性骨嚢胞による病的骨折と白質脳症による若年性認知症を主徴とする常染色体劣性遺伝疾患で、19q13.12染色体上のTYROBP(DAP12)遺伝子または6p21.1染色体上のTREM2遺伝子のloss of functionを認める。脳ではTREM2(リガンド受容体)-DAP12(アダプター)複合体はミクログリア(microglia; MG)に限局して発現しているが、ヒト脳のTREM2リガンド(TREM2L)は明らかでない。NHD白質脳症発症におけるMGの役割は明らかでない。本研究では白質脳症発症機構を明らかにするため、「NHDではMGがTREM2-DAP12系を介するネガティブフィードバック機構の欠失により持続的に活性化されて、炎症が慢性化して白質脳症が誘導される」との仮説を考案した。この仮説を検証するために、研究期間3年間で(1)NHD剖検脳でMGの活性化状態を免疫組織化学的に解析し、(2)TREM2Lを同定し、(3)ヒトMG培養モデル系でTREM2-DAP12シグナル伝達系ネットワークを明らかにし、(4)MG異常活性化の制御薬をスクリーニングし、NHDの脳分子病態の解明と治療薬の開発を目指す。また(5)NHDを次世代シークエンサーによるtargeted sequencing 法で迅速かつ網羅的に診断する方法を開発する。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

【進捗状況】NHD脳でP2RY12, p22phox, gp91phox, ABI3, GPR17を免疫組織化学的に解析したが、他のマーカー(M0: TMEM119; M1: iNOS, CD14, CD40, CD74, CD80, CD86, HLA-DR; M2a: CD33, CD204, CD206, CD209; M2b: CD16, CD32, CD64; M2c: CD163)の解析が大幅に遅れた。NHD脳でMGは遊走や突起の伸長を制御しているGi/o共役型プリン作動性受容体P2RY12を高発現していた。NHD脳でreactive oxygen species(ROS)産生に関与するNADPH oxidase catalytic subunits p22phox, gp91phoxの発現を解析した結果、両者はMG限局的に発現し、コントロール脳に比較してgp91phoxの発現上昇を認めた。NHD白質脳症の発症機序としてMGが産生するROSを介するオリゴデンドロサイト(oligodendrocytes; OL)の傷害が考えられた。Alzheimer病(AD)のリスクバリアントp.Ser209Pheが報告されているABI family member 3(ABI3)はコントロール脳、AD脳、NHD脳でMG限局的に発現しており、発現量に有意差はみられなかった。NHD脳でOL分化誘導因子G protein-coupled receptor 17(GPR17)の発現を解析したところ、premyelinating OLで発現を認め、コントロール脳と比較して、発現差異は認められなかった。またProtoArray Human Protein MicroarrayをTREM2-V5プローブと反応させ、TREM2結合分子(TREM2L候補)としてcardiolipinを同定した。

今後の研究の推進方策

【推進方策】最終年度(平成30年度)は、ヒトMG培養モデル系(iMG)をTREM2L(cardiolipin)で刺激し、遺伝子発現プロフィールをDNAマイクロアレイで経時的に解析し、TREM2-DAP12シグナル伝達系ネットワークの全容を明らかにする。またiMGでsiRNAを用いてTREM2をノックダウン(NHDの病態を反映)した時に、発現変動する遺伝子群(TREM2標的遺伝子群)をDNAマイクロアレイで同定する。そのうちTREM2ノックダウンiMGで、顕著に発現上昇した遺伝子を指標に、指標遺伝子の発現レベルを正常化する薬剤(MG異常活性化制御薬)を既存薬(抗炎症薬など)の中からqPCRやウェスタンブロットでスクリーニングする。TREM2欠損はADモデルマウス脳においてアミロイドベータ(Abeta)の蓄積を増加する方向に働く。TREM2-DAP12シグナリングの欠失したNHD脳において、Abetaとneurofibrillary tangle(NFT)の蓄積が認められるか調べる。那須ハコラ病の遺伝子変異の一つTREM2 c.482+2T>CはTREM2 intron 3のsplice donor siteが破綻し、exon 3がスキップされ、full lengthのTREM2 proteinが出来なくなる変異である。この変異に着目して、exon 3のスキップが起こらないように矯正出来るmodified small nuclear RNAs(snRNAs)をデザインする。

次年度使用額が生じた理由

平成28-29年度の研究の遅れにより、次年度使用額が生じた。平成30年度では遅れを取り戻すために、主としてNHD脳MGの活性化マーカーの解析およびTREM2-DAP12シグナル伝達系の解明に、次年度繰越金を使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Microglia express ABI3 in the brains of Alzheimer's disease and Nasu-Hakola disease (2017)
  • 著者名/発表者名: Satoh J, Kino Y, Yanaizu M, Tosaki Y, Sakai K, Ishida T, Saito Y
  • 雑誌名: Intractable & Rare Diseases Research 巻: 6 ページ: 262-268
  • DOI: 10.5582/irdr.2017.01073
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Adult onset leukoencephalopathy with axonal spheroids and pigmented glia (ALSP) and Nasu-Hakola disease: lesion staging and dynamic changes of axons and microglial subsets (2017)
  • 著者名/発表者名: Oyanagi K, Kinoshita M, Suzuki-Kouyama E, Inoue T, Nakahara A, Tokiwai M, Arai N, Satoh JI, Aoki N, Jinnai K, Yazawa I, Arai K, Ishihara K, Kawamura M, Ishizawa K, Hasegawa K, Yagisita S, Amano N, Yoshida K, Terada S, Yoshida M, Akiyama H, Mitsuyama Y, Ikeda SI
  • 雑誌名: Brain Pathology 巻: 27 ページ: 748-769
  • DOI: 10.1111/bpa.12443
  • 査読あり
• [学会発表] Adult onset leukoencephalopathy with axonal spheroids and pigmented glia (ALSP) and Nasu-Hakola disease. Lesion staging and dynamic changes of axons and microgial subsets. (2017)
  • 著者名/発表者名: Oyanagi K, Kinoshita M, Nakahara A, Satoh J, Aoki N, Jinnai K, Yazawa I, Arai K, Ishihara K, Kawamura M, Arai N, Hasegawa K, Yagishita S, Amano N, Yoshida K, Terada S, Yoshida M, Akiyama H, Mitsuyama Y, Ikeda S
  • 学会等名: XXIII World Congress of Neurology
  • 国際学会
• [学会発表] C9orf72結合タンパク質Smcr8の機能の解析. (2017)
  • 著者名/発表者名: 三好潤子、山本洋司、滝谷美香、紀嘉浩、佐藤準一
  • 学会等名: 日本薬学会第137年会
• [学会発表] 筋萎縮性側索硬化症・前頭側頭葉型認知症と関連するジペプチドリピート凝集体の解析. (2017)
  • 著者名/発表者名: 滝谷美香、三好潤子、紀嘉浩、佐藤準一
  • 学会等名: 日本薬学会第137年会
• [学会発表] 那須ハコラ病スプライス部位変異に対する新規治療アダプター分子の開発. (2017)
  • 著者名/発表者名: 柳津茂慧、酒井健治、戸崎陽平、紀嘉浩、佐藤準一
  • 学会等名: 日本薬学会第137年会
• [学会発表] 培養細胞におけるDAP12相互作用検出系の構築. (2017)
  • 著者名/発表者名: 戸崎陽平、酒井健治、柳津茂慧、成田由希美、紀嘉浩、佐藤準一
  • 学会等名: 日本薬学会第137年会
• [学会発表] FUS/TLSによるPtk2b選択的スプライシング制御機構の解析. (2017)
  • 著者名/発表者名: 酒井健治、戸崎陽平、柳津茂慧、木村美咲、紀嘉浩、佐藤準一
  • 学会等名: 日本薬学会第137年会
• [学会発表] 那須ハコラ病の原因となるTREM2スプライス部位変異に対する治療分子. (2017)
  • 著者名/発表者名: 紀嘉浩、柳津茂慧、佐藤準一
  • 学会等名: 第40回日本神経科学大会
• [学会発表] 蛍光性アプタマーを用いた神経疾患関連リピートRNAの可視化. (2017)
  • 著者名/発表者名: 紀嘉浩、正木泰行、滝谷美香、佐藤準一
  • 学会等名: 第40回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 改変型U1snRNAを用いたTREM2那須ハコラ病関連スプライシング異常の矯正. (2017)
  • 著者名/発表者名: 柳津茂慧、酒井健治、戸崎陽平、紀嘉浩、佐藤準一
  • 学会等名: 第40回日本分子生物学会年会
• [備考] 明治薬科大学バイオインフォマティクス研究室ホームページ
  • URL: https://u-lab.my-pharm.ac.jp/~satoj/