研究課題
「４．糖鎖付加変異細胞によるγセクレターゼの基質選択性の変化の検討」Lec-1細胞において、生化学実験レベル・細胞実験レベルでともにAβの産生が有意に低下していた。Aβ産生低下の原因が、C99とγセクレターゼの相互作用の低下によるのか否か検討するために、C99-FLAG結合磁気ビーズを調製し、これをLec-1細胞の膜フラクションのCHAPSO可溶化で得られた可溶化γセクレターゼと混合し、C99に結合するγセクレターゼ構成因子（Nicastrin, Presenilin 1 CTF, Aph-1, Pen-2）量を検討した。その結果、いずれの構成因子も、野生型CHO細胞のγセクレターゼ構成因子と比較して、C99への結合量に変化は見られなかった。このことからLec-1のγセクレターゼは、基質への結合能ではなく切断活性そのものが低下していると考えられる。「５．グリコシダーゼ処理による糖鎖除去Nicastrin含有γセクレターゼの基質選択性の変化の検討」野生型CHO細胞からNicastrinのアフィニティー精製で得たγセクレターゼをPNGaseやEndoF処理し、基質選択性の比較検討を試みた。その結果、いずれの処理においてもγセクレターゼの活性を得ることができなかった。これらのグリコシダーゼ処理時に微量のSDSや還元剤を添加したことが原因と考えられる。そこで、糖鎖修飾阻害剤のKifunensineを細胞に処理してγセクレターゼの基質特異性を検討した。まず、Kifunensine処理によりNicastrinの糖鎖修飾の未成熟を確認した。そこで、C99からのAβ産生やNotch切断を検討すると、いずれの場合も減少していることがわかった。「６．Nicastrin欠失細胞の作製」現在作製準備中である。
3: やや遅れている
当初予定していたNicastrin欠失細胞の作製に至っていないため。それ以外は順調に進行した。
当初の計画通り、γセクレターゼの糖鎖修飾と基質選択性の関連を検討する。特にNicastrin欠失細胞を作製し、基質選択性に関与する糖鎖の同定に取りかかる予定である。
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Genes to Cells
巻: 23 ページ: 22-34
10.1111/gtc.12544
