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2016 年度 実施状況報告書

神経発達に伴う細胞サイズ制御機構の解明と病態モデルの確立

研究課題

研究課題/領域番号 16K07053
研究機関新潟大学

研究代表者

武井 延之  新潟大学, 脳研究所, 准教授 (70221372)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワードmTOR / 細胞サイズ / 神経発達 / neural stem cell / 脳形成異常 / シグナル伝達 / 蛋白合成 / 神経栄養因子
研究実績の概要

実績の概要を研究計画のサブテーマごとに記載する。
①神経幹細胞と神経細胞におけるm TO R シグナルの違いとそれを誘起する因子を解明する。1)シグナルの違い:ラットからneurosphere を調整し、定法に従って維持及び分化誘導を行なった。神経幹細胞(neurosphere状態)、神経前駆細胞(単層培養)、分化誘導神経細胞と初代培養神経細胞を各種マーカー蛋白の発現で同定した後、それぞれのmTORシグナル系の活性化状態を調べた。mTOR のキナーゼ活性測定、およびリン酸化特異抗体を用いた基質(p70S6K と4EBP)のリン酸化レベルの変動を明らかにした(結果に関しては未発表の為、非公表)。さらに分化状態によってS6Kのp70とp85の比率が変化することも見いだした。このことの生理的意義は不明だが、S6Kの活性測定を計画している。2) 細胞外因子の作用:基質接着因子(ラミニンなど)によってmTOR活性が変化することを見いだしたが、詳細については現在検討中である。3) 細胞サイズの比較:細胞の発達の各段階でそれぞれのマーカーの抗体と、細胞膜染色試薬の二重染色像を行って、画像を取得していおり、順次3次元再構成をおこなってデータを解析している。Sphere形成時の細胞に比較して分化後では数倍~10倍の細胞容量の増大が確認されている。
②ゲノム編集:ゲノム編集に関しては、神経幹細胞への遺伝子導入効率の悪さもあって難航している。並行してエレクトロポレーションによる通常のmTOR活性型変異体の過剰発現を行い、一過性の発現に関しては(効率は悪いが)安定している。しかし一過性発現では細胞サイズの変動にまで至らないことが多く、現在株化を行っている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

H28年度の研究はおおむね当初の計画通りに進展している。ゲノム編集に関しては当初の危惧通り難航しているが、代替策としてのmTOR活性型変異体の過剰発現によって細胞サイズ途の関連や分化との関連は解明できると考えられる。しかしながら病態モデルとしてはゲノム編集が望ましいので、引き続き専門家の助言をもらいながら試行し、成功させたい。
その他、mTORシグナルに関して末梢組織や癌細胞、さらには冬眠動物脳における知見が得られたのは、新たな研究の展開につながるseedsといえる。

今後の研究の推進方策

H29年度の計画としていた蛋白合成、脂質合成と細胞サイズの変化については、H28年度中に予備的な結果が得られた。分化段階に応じた蛋白合成、脂質合成について追試を行い、定量データを集め、確定させる予定である。また病態モデルとしては、以下の2つを行う。
1)子宮内エレクトロポレーション法により、mTOR活性型変異を胎仔に発現させ、細胞の形態、サイズを解析する。
2)mTOR活性型変異体を安定発現した神経幹/前駆細胞を胎仔(新生仔)の脳内に移植し、in vivoでの成長/変化を解析する。

次年度使用額が生じた理由

今年度の実験が主に培養系であり、物品(培養用器具、抗体、試薬等)が予想より節約できた。新たな種類の実験に必要なものは次年度に購入予定なので、繰り越した。限られた資金を節約して有効に使用できたと考えている。

次年度使用額の使用計画

新たな実験の為、29年度は物品費が増加する見込みであり、主に試薬、キット等の消耗品に充当する予定である。
また29年度には論文発表を予定しており、英文校正費、投稿料などに使用予定である。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 2件)

  • [雑誌論文] Glutamate-Dependent Ectodomain Shedding of Neuregulin-1 Type II Precursors in Rat Forebrain Neurons.2017

    • 著者名/発表者名
      1)Iwakura Y, Wang R, Inamura N, Araki K, Higashiyama S, Takei N, Nawa N
    • 雑誌名

      PLoS One

      巻: 12 ページ: -

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0174780

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Advanced glycation end products induce brain-derived neurotrophic factor release from human platelets through the src-family kinase activation.2017

    • 著者名/発表者名
      2)Furukawa K, Fuse I, Iwakura Y, Sotoyama H, Hanyu O, Nawa H, Sone H, Takei N
    • 雑誌名

      Cardiovasc. Diabetol

      巻: 16 ページ: -

    • DOI

      10.1186/s 12933- 017-0505-y

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Anticancer activity of antipsychotics on brain tumors2017

    • 著者名/発表者名
      Yutaro Kobayashi, Kohtaro Irie, Ayana Kawase, Nobuyuki Takei, Hiroyuki Nawa
    • 学会等名
      7th International Society of Radiation Neurobiology Meeting
    • 発表場所
      ホテル双葉(新潟県南魚沼郡湯沢町)
    • 年月日
      2017-02-09 – 2017-02-10
    • 国際学会
  • [学会発表] 冬眠期のシマリス神経細胞におけるAMPKを上流とした翻訳制御2016

    • 著者名/発表者名
      山田新太郎、関島恒夫、那波宏之、武井延之
    • 学会等名
      第59回日本神経化学会
    • 発表場所
      福岡国際会議場(福岡県福岡市)
    • 年月日
      2016-09-08 – 2016-09-10
  • [学会発表] Epidermal growth factor downregulates presynaptic maturation and suppresses synapse formation in vitro and in vivo.2016

    • 著者名/発表者名
      Takei N, Yokomaku D, Ushiki D and Nawa H
    • 学会等名
      7th ISN Special Conference, Synaptic function and dysfunction in brain diseases
    • 発表場所
      Coimbra, Portugal
    • 年月日
      2016-06-01 – 2016-06-04
    • 国際学会

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公開日: 2018-01-16  

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