| 研究課題/領域番号 |
16K07058
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
山本 秀幸 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60191433)
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| 研究分担者 |
仲嶺 三代美 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20381105)
鳥原 英嗣 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50757218)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | CaMキナーゼII / 神経細胞 / プロテインキナーゼD / リン酸化反応 / GnRH / GT1-7細胞 / PYK2 / Src |
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| 研究実績の概要 |
プロテインキナーゼD(PKD)は、Cキナーゼにより活性化されることが知られているが、その生理機能は不明である。カルモデュリンキナーゼII(CaMキナーゼII)は、カルシウムイオンとCaMによって活性化される。PKDは触媒ドメインの構造と基質特異性の類似性からCaMキナーゼファミリーに属し、CaMキナーゼIIと類似した生理機能を持つことが示唆されている。応募者らは、マウスの視床下部の神経細胞の培養細胞株であるGT1-7細胞を用いて、PKDがCキナーゼからチロシンキナーゼ系への情報伝達に関与することを見いだした。また、CaMキナーゼIIも同一のチロシンキナーゼ系を活性化することを示唆する実験結果を得た。今回の研究計画は、両酵素によるチロシンキナーゼ系の活性化の分子機構を解明することを目的としている。その目的で、以下の実験を行う計画である。1)PKD1とCaMキナーゼIIδ2がFynとPyk2の402番目のチロシン残基のリン酸化を促進させて、FynとPyk2との結合を促進させる可能性を検討する。2)アルカリホスファターゼを融合させたHB-EGF前駆体を細胞に安定的に発現させる。培養液中のアルカリホスファターゼ活性を測定し、Pyk2がHB-EGF前駆体の切断を介してErbBファミリーを活性化させる可能性を検討する(前年度終了)。3)Pyk2がErbB4とEGFRを直接にリン酸化して活性化する可能性を、Pyk2のノックダウン実験と過剰発現実験により検討する。さらに、Pyk2及びErbB4とEGFRをGT1-7細胞で過剰発現させて免疫沈降法により回収し、in vitroでのリン酸化を検討する。リン酸化された場合、遺伝子工学的手法を用いてリン酸化部位を決定する。4)PKD1とCaMキナーゼIIδ2によりリン酸化されるタンパク質を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1.PKD1とCaMキナーゼIIによるPYK2の活性化の検討
PKDの中のPKD1のノックダウンと阻害剤の添加によりPYK2の402番目のチロシン残基(Y402)のリン酸化が抑制された。また、CaMキナーゼIIδ2のノックダウンと阻害剤によっても同様の結果が得られた。我々は既に、GT1-7細胞では、Y402はFynによりリン酸化されることを見いだしており、両酵素はFynによるPYK2のY402のリン酸化を促進させると考えられる。Y402のリン酸化はPYK2とFynの結合をさらに増強させて、活性部位のY579とY580をリン酸化してPYK2を活性化すると思われる。
2.Pyk2によるErbBファミリーの活性化の分子機構の解明
応募者らは、HB-EGF前駆体の切断を容易に測定する系を開発した。この系を用いて、Pyk2がHB-EGF前駆体の切断に関与する可能性を検討した。siRNAを用いたノックダウン実験の結果から、Pyk2はHB-EGF前駆体の切断には関与しないことが明らかになった。今後は、活性化型Pyk2がErbBファミリーの中のEGFRかErbB4を直接にリン酸化して活性化する可能性を検討する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.PKD1とCaMキナーゼIIによるPYK2の活性化の検討
1)前年度に、CaMキナーゼIIδ2を過剰に発現するGT1-7細胞のクローンを樹立した。このクローンでは、PYK2の402番目のチロシン残基(Y402)のリン酸化が増強されているかを検討する。次に、このクローンではPYK2とFynの結合が増強されているかを検討する。2)PKD1とCaMキナーゼIIδ2のノックダウンにより、Y402のリン酸化とPYK2とFynとの結合が抑制されるかを検討する。3)Y402をフェニルアラニンに置換したPYK2の変異体を作製する。この変異体をGT1-7細胞で過剰に発現させ、PKD1とCaMキナーゼIIを活性化させてもFynとPYK2の結合が増強されないことを確認する。
2.Pyk2によるErbBファミリーの活性化の分子機構の解明
PYK2をGT1-7細胞で過剰発現させ活性化処理を行う。活性化されたPYK2を免疫沈降法により回収する。同様に過剰発現させたEGFRとErbB4を免疫沈降法により回収し、PYK2によるチロシン残基のリン酸化が起こるかを放射性同位元素を用いて検討する。免疫ブロットでも検討する予定である。
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