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2017 年度 実施状況報告書

神経細胞でのCaMキナーゼファミリーによるチロシンキナーゼ系の活性化反応

研究課題

研究課題/領域番号 16K07058
研究機関琉球大学

研究代表者

山本 秀幸  琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60191433)

研究分担者 仲嶺 三代美  琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20381105)
鳥原 英嗣  琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50757218)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード視床下部神経細胞 / GPCR / ゴナドトロピン放出ホルモン / CaMキナーゼII / プロテインキナーゼD / Fyn / Pyk2 / 上皮成長因子受容体
研究実績の概要

研究代表者らは、これまでにマウスの視床下部の神経細胞の培養細胞株であるGT1-7細胞を用いて、Gタンパク質共役受容体(GPCR)の一つであるゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)受容体刺激後の細胞内シグナル伝達機構について検討してきた。2年前に、プロテインキナーゼD(PKD)がチロシンキナーゼ系の活性化に関与することを見いだした。また、カルモデュリンキナーゼII(CaMキナーゼII)は、神経細胞に多く発現しており、カルシウムイオンとCaMによって活性化される。PKDは触媒ドメインの構造と基質特異性の類似性からCaMキナーゼファミリーに属し、CaMキナーゼIIと同様の生理機能を有することが示唆されている。我々は、チロシンキナーゼの中のproline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2)と上皮成長因子受容体(EGFR)の活性化機構を研究してきた。これまでに、Pyk2の活性化機構については、PKDとCaMキナーゼIIがSrcファミリーの中のFynとPyk2の相互作用を増強させることが明らかになってきた。この分子機構により、GnRH受容体刺激後にPyk2がFynにより活性化されると考えられる。また、EGFRのリガンドの一つであるHB-EGFの産生を測定する系を確立し、Pyk2が細胞膜に存在するHB-EGF前駆体を切断してHB-EGFの産生に関わる可能性を見いだした。産生されたHB-EGFがEGFRを活性化すると考えられる。PKDとCaMキナーゼIIは、Gq/11と共役するGPCRによって活性化される。すなわち、今回の研究は、GnRH受容体以外の多くのGq/11と共役するGPCRについての細胞内シグナル伝達機構を解明する上でも有用な知見を提供するものである。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成29年度までに以下の三つの研究成果が得られた。
1.我々は、GT1-7細胞では、PKDとCaMキナーゼIIのアイソフォームとして、それぞれ、PKD1とデルタ2が主に発現していることを見いだした。それぞれのsiRNAを用いたノックダウン実験と阻害薬を用いた薬理学的実験および過剰発現実験により、両者がGnRH受容体刺激後のPyk2の活性化に関与することを見いだした。Pyk2を直接に活性化するのはFynであり、PKD1とCaMキナーゼIIデルタ2は、Pyk2とFynの相互作用を促進させると考えられる。
2.我々は、アルカリフォスファターゼとHB-EGF前駆体の融合タンパク質をGT1-7細胞に過剰発現させ、細胞培養液中のアルカリフォスファターゼの活性を測定することで簡便にHB-EGF前駆体の切断を測定する系を確立した。この系を用いて、Pyk2がHB-EGF前駆体の切断に関与することが明らかになった。
3.これまでに見いだしたPKD1とCaMキナーゼIIの作用が、下垂体のゴナドトロピン産生細胞でも機能していることを確認した。これらの結果は、見いだしたシグナル伝達機構の普遍性を示唆するものである。
よって、本研究課題の進捗状況として、おおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

今後は、以下の三つの内容について検討していく予定である。
1. PKD1とCaMキナーゼIIデルタ2がPyk2とFynの相互作用を促進させる分子機構を明らかにする。我々は、FIP200とよばれるPyk2の阻害タンパク質がGT1-7細胞に多量に発現していることを見いだした。さらに、FIP200がPyk2と結合していることを確認した。今後は、まず、FIP200をノックダウンすることで、Pyk2のFynによる活性化が起こるかを検討する。さらに、PKD1とCaMキナーゼIIによりFIP200がリン酸化されてPyk2に対する阻害作用が減弱する可能性を検討する。
2.これまでに開発したHB-EGF前駆体の切断機構の解析方法を駆使して、Pyk2によるHB-EGF前駆体の切断の分子機構を解明する。まず、HB-EGF前駆体を切断するタンパク質分解酵素を明らかにする。次に、明らかになったタンパク質分解酵素がPyk2によってリン酸化されて活性化される可能性を検討する。リン酸化が検出できない場合は、別の可能性として、Pyk2がHB-EGF前駆体とタンパク質分解酵素の相互作用を促進させる可能性を検討する。この実験では、不活性型のタンパク質分解酵素をGT1-7細胞に発現させて検討する予定である。
3.これまでに見いだした細胞内シグナル伝達機構が他のGPCR刺激でも機能しているかを検討する。まず、下垂体前葉細胞の培養細胞であるGH3細胞を用いて、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体刺激後のPyk2の活性化とその分子機構を検討する。次に、副腎髄質細胞の培養細胞であるPC12細胞を用いて、ブラディキニン受容体刺激後のPyk2の活性化とその分子機構を検討する。これらの研究により、我々が見いだした細胞内シグナル伝達機構が様々な細胞で機能していることが明らかになるものと期待される。

  • 研究成果

    (16件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (12件) (うち国際学会 2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Phosphorylation of epidermal growth factor receptor at serine 1047 in cultured lung alveolar epithelial cells by bradykinin B2 receptor stimulation.2018

    • 著者名/発表者名
      Izumi S, Higa-Nakamine S, Nishi H, Torihara H, Uehara A, Sugahara K, Kakinohana M, Yamamoto H.
    • 雑誌名

      Pulm Pharmacol Ther

      巻: 48 ページ: 53-61

    • DOI

      10.1016/j.pupt.2017.09.002

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Action of naftopidil on spinal serotonergic neurotransmission for inhibition of the micturition reflex in rats.2017

    • 著者名/発表者名
      Sugaya K, Nishijima S, Kadekawa K, Ashitomi K, Ueda T, Yamamoto H, Hattori T.
    • 雑誌名

      Neurourol Urodyn

      巻: 36 ページ: 604-609

    • DOI

      10.1002/nau.23028. Epub 2016 Apr 29.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Naftopidil Improves Symptoms in a Rat Model of Tranilast-Induced Interstitial Cystitis.2017

    • 著者名/発表者名
      Sugaya K, Nishijima S, Kadekawa K, Ashitomi K, Ueda T, Yamamoto H.
    • 雑誌名

      Low Urin Tract Symptoms

      巻: 9 ページ: 107-110

    • DOI

      10.1111/luts.12113. Epub 2015 Sep 26.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Activation of PYK2 by PKD and CaM kinase II in cultured hypothalamic neurons2017

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Yamamoto. Sayomi Higa-Nakamine, Shiho Okitsu, Hidetsugu Torihara
    • 学会等名
      INS-ENS meeting
    • 国際学会
  • [学会発表] Cleavage of ErbB4 after G-protein -coupled receptor stimulation in hypothalamic neurons and anterior pituitary cells2017

    • 著者名/発表者名
      Sayomi Higa-Nakamine, Yujiro Omoto, Hideyuki Yamamoto
    • 学会等名
      INS-ENS meeting
    • 国際学会
  • [学会発表] ゼブラフィッシュを用いたリボソームタンパク質S19のリン酸化による造血機能制御の解析2017

    • 著者名/発表者名
      鳥原英嗣、仲嶺(比嘉)三代美、渡名喜健、前田紀子、上地珠代、中島由香里、剣持直哉、山本秀幸
    • 学会等名
      平成29年度日本生化学会九州支部例会
  • [学会発表] GnRH受容体刺激によるチロシンキナーゼPYK2の活性化反応へのCaMキナーゼIIの関2017

    • 著者名/発表者名
      澳津志帆、高橋華、仲嶺(比嘉)三代美、鳥原英嗣、山本秀幸
    • 学会等名
      平成29年度日本生化学会九州支部例会
  • [学会発表] Involvement of the CaM kinase family in signal transduction that stimulates the tyrosine kinase pathway in response to gonadotropin-releasing hormone2017

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Yamamoto. Sayomi Higa-Nakamine, Shiho Okitsu, Hidetsugu Torihara
    • 学会等名
      第60回日本神経化学会大会
  • [学会発表] 培養視床下部神経細胞におけるCaMキナーゼファミリーを介したチロシンキナーゼPYK2の活性化反応2017

    • 著者名/発表者名
      山本秀幸、仲嶺(比嘉)三代美、澳津志帆、鳥原英嗣
    • 学会等名
      第70回日本薬理学会西南部会
  • [学会発表] 培養視床下部神経細胞におけるFynによるPYK2の活性化機構2017

    • 著者名/発表者名
      仲嶺(比嘉)三代美、桑江一希、山本秀幸
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] 培養視床下部神経細胞でのGnRHによるPYK2活性化反応へのCaM kinase Ⅱの関与2017

    • 著者名/発表者名
      澳津志帆、仲嶺(比嘉)三代美、鳥原英嗣、東山繁樹、山本秀幸
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] 受容体型チロシンキナーゼEphA4の高分化型腫瘍における抗癌剤耐性能について2017

    • 著者名/発表者名
      喜名振一郎、山本秀幸、仲嶺(比嘉)三代美、鳥原英嗣、金城貴夫、新崎章
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] ゴナドトロピン産生細胞でのGnRH受容体刺激によるERKの活性化反応とErbB4の切断反応2017

    • 著者名/発表者名
      山本秀、大本裕次郎、澳津志帆、仲嶺(比嘉)三代美
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] ゼブラフィッシュDBAモデルを用いたリボソームタンパク質S19のリン酸化による造血機能制御の解析2017

    • 著者名/発表者名
      鳥原英嗣、仲嶺(比嘉)三代美、渡名喜健、前田紀子、上地珠代、中島由香里、剣持直哉、山本秀幸
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [学会発表] Gタンパク質共役型受容体刺激による上皮成長因子受容体の1047番目のセリン残基のリン酸化反応2017

    • 著者名/発表者名
      和泉俊輔、仲嶺(比嘉)三代美、西啓亨、鳥原英嗣、上原綾子、須加原一博、垣花学、山本秀幸
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [備考] 琉球大学大学院医学研究科 生化学講座

    • URL

      http://biochem.med.u-ryukyu.ac.jp

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公開日: 2018-12-17  

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