| 研究課題/領域番号 |
16K07071
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| 研究機関 | 同志社大学 |
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研究代表者 |
渡辺 祥司 同志社大学, 研究開発推進機構, 助教 (80462745)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | タウ / 軸索 / 局在化機構 / 蛋白質半減期 |
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| 研究実績の概要 |
微小管結合蛋白質の一つであるタウ蛋白質は、通常、神経細胞の軸索に局在し、微小管構造を安定化させる重要な役割を担っている。一方、アルツハイマー病をはじめとする認知機能が消失する疾患において、タウ蛋白質は細胞体や樹状突起にも異常局在し、様々な細胞毒性を惹起する。本来軸索に局在するタウ蛋白質が、何故異常局在を示し、神経細胞に対する毒性を獲得するのかを理解するためには、生理的条件下でのタウの局在化機構を知ることが極めて重要である。現在までにタウ蛋白質に関する報告は多数されているが、局在化機構の詳細は不明のままである。そこで、独自に構築した発現系を利用し、タウの軸索局在の分子機序を明らかにすることを目的とし、研究を開始した。
本年度（平成２８年度）は、タウ蛋白質の半減期と軸索局在との関連を明らかにすることを目的とし、タウ蛋白質の半減期の測定を行なうことを試みた。ラットの海馬由来の初代培養神経細胞を材料とし、独自に改良したドキシサイクリン発現誘導系を用いた解析により、タウ蛋白質の局在変化を経時的に観察した。ドキシサイクリンによりGFPを融合したタウ蛋白質を一定量発現させると、軸索にのみ局在するまでに約2週間必要であった。なお、内在性のタウ蛋白質も軸索のみに局在するためには、ほぼ同じ期間必要であった。また、発現を開始したときと、軸索のみに局在した後のタウ蛋白質に付加させているGFPの蛍光強度には顕著な差はみられなかった。この結果から、内在性・外因性に関わらずタウ蛋白質は非常に長い蛋白質半減期（少なくとも2週間）を有していることが予想される。アルツハイマー病を含む神経変性疾患の原因蛋白質の半減期は、種々の異常を引き起こす要因となることが多いことから、引き続き詳細な解析をしたいと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
メチオニンアナログであるアルキル化ホモアラニン（AHA）を用いて、一定時間発現させたタウ蛋白質を含む新生蛋白質をパルス標識する。そして、任意の時間毎に細胞を回収し、調製した細胞抽出液をClick反応により新生蛋白質をビオチン化する。それらをストレプトアビジンビーズにより回収して、免疫沈降後、ウェスタンブロッティングを行ない、タウ蛋白質の半減期を決定することを本年度（平成２８年度）の目標として実験を進めた。
はじめに、神経細胞ではなく、培養細胞株であるHEK293株で解析を行なった。出芽酵母由来の組み換えシステムを利用したシングルコピーの安定株の樹立を行ない、上記手法でタウ蛋白質の半減期を測定した。その結果、少なくとも2日間はタウ蛋白質の減衰は見られなかったことから、培養細胞でもタウ蛋白質の半減期は長いことが考えられた。以上のHEK細胞を用いた実験より、非RI条件によりタウ蛋白質を標識し、半減期を測定する手法は成功していると判断した。
つぎに、ラットの海馬由来の初代培養神経細胞で同様の実験を行なうことを試みた。AHAによりタウ蛋白質を標識し、経時的にサンプルを回収し、最終的にウェスタンブロッティングにより確認するために必要な細胞数を決定したところ、相当数のラット胎児が必要であり、非効率的であると判断した。そこで、海馬ではなく大脳皮質由来の初代培養神経細胞を用いて解析することにした。一匹の妊娠ラットから得られる胎児より、タウ蛋白質の標識実験を経時的に調べるために必要な細胞数を確保することができることを確認し、現在、引き続きタウ蛋白質の半減期の測定を行なっている。
以上のことから、若干の遅れは見られるものの、神経細胞を用いて半減期を測定する実験手法を確立し、以降の実験はスムーズに進めていけると考えられることから、概ね順調であると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度（平成２８年度）に完了しなかったタウ蛋白質の半減期を速やかに終了させる。その結果に基づき、タウ蛋白質の半減期と局在との関連を考察する。
それ以降の研究に関しては、当初の予定通り大腸菌由来のビオチン化酵素変異体を用いて、タウ蛋白質の軸索局在を規定する因子の特定を目指す。また、本年度の研究の過程で、タウ蛋白質の発現時期とその量が、正しい場所に局在するために極めて重要な要因であることを見出した。しかしながら、タウの発現を調節する転写因子は、現在まで明らかにされていない。そこで、ビオチン化酵素変異体とCRISPAR/Cas9を組み合わせたユニークな手法を利用し、タウの発現調節を行なっている転写因子の同定も並行して行なう予定である。使用するレンチウィルスベクター等の準備は済ませていることから、滞りなく進めていけると考えている。
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