| 研究課題/領域番号 |
16K07071
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| 研究機関 | 同志社大学 |
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研究代表者 |
渡辺 祥司 同志社大学, 研究開発推進機構, 助教 (80462745)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | タウ / 軸索 / 局在化機構 |
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| 研究実績の概要 |
タウ蛋白質は微小管結合蛋白質の一つであり、生理的条件下では神経細胞の軸索にのみ局在し、微小管を安定化させる重要な役割を担っている。現在までに、タウ蛋白質が軸索に局在する分子機構は明らかにされておらず、それを明らかにするために継続して研究を行なってきた。昨年度（平成28年度）の研究により、タウ蛋白質の半減期は2週間以上あることを明らかにした。また、タウ蛋白質の軸索に正しく局在するためには、蛋白質半減期よりも発現時期に大きく依存していることを明らかにした。
今年度（平成29年度）は、タウ蛋白質の軸索局在を規定する因子を特定することを目的として研究を行なった。ビオチン化酵素変異体または酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、タウ蛋白質と相互作用し、かつ局在に関与する可能性のある因子を同定するために全長タウ蛋白質を用いて解析を行なうと、非常に多くの候補因子が取得され、その後の解析に支障をきたす可能性が考えられる。そこで、まずタウ蛋白質が軸索に局在するために必要な部位を特定することを目的として、様々な欠失変異体を構築し、独自の発現系を利用して軸索へ正しく局在するか否かを検討した。その結果、微小管結合領域の直前にあるプロリンが豊富に存在するPR2ドメインが軸索局在に必要であることを示唆する結果を得た。また興味深いことに、微小管結合領域は、軸索局在に必須ではないことが明らかになった。タウ蛋白質のPR2ドメインは8個のリン酸化部位が存在しており、この領域のリン酸化状態が軸索局在に関与しているのではないかと考え、擬似リン酸化および擬似非リン酸化変異体を作成し、その局在を調べた所、擬似非リン酸化変異体の軸索局在が著しく阻害された。以上、今年度の解析により、タウ蛋白質の軸索局在にはPR2ドメインのリン酸化状態が重要な役割を担っているという現在までに報告されていない新しい知見を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度（平成29年度）、タウ蛋白質の軸索局在を規定する因子を特定するために、大腸菌由来のビオチン化酵素変異体または酵母ツーハイブリッド実験を行なうことを予定していた。しかし、全長のタウ蛋白質を標的として解析を行なうと、局在を規定する因子だけではなく、タウ蛋白質の近傍に位置する、または相互作用する多くの蛋白質が候補として挙がってくることが予想される。また、得られた候補蛋白質から軸索局在に重要な蛋白質のみを選別することは非常に効率が悪いのではないかと判断した。そこで、まずタウ蛋白質のどの領域が軸索局在に必要であるかを特定することにした。一連の解析により、タウ蛋白質が軸索に局在するためにはプロリンリッチリージョン2（PR2）が重要であること、およびPR2のリン酸化が重要であることを見出した。今年度の解析により得られた結果に基づき、タウ蛋白質のPR2ドメインをBait（餌）にして、現在、酵母ツーハイブリッド実験を行っている。
効率良く軸索局在を規定する因子を特定するために、予定していなかった解析を優先して行なったため、若干の遅れは見られるが、以後の研究はスムーズに進めていけると考えていることから、概ね順調であると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度（平成29年度）に完了しなかったタウ蛋白質の軸索局在を規定する因子を、酵母ツーハイブリッド実験により速やかに特定する。因子の特定後は、当初の予定通りshRNAによる発現抑制によりタウ蛋白質の局在にどの様な影響を及ぼすのかを検討する。また、今年度（平成30年度）に予定している、タウ蛋白質が軸索に局在するまでの時系列変化に関する研究に関しても並行して行なう予定である。使用するレンチウィルスベクター等の準備は済ませてあることから、滞りなく進めていけると考えている。
また、昨年度からの一連の解析により、タウ蛋白質の発現時期とその量が軸索局在に極めて重要であることを見出している。タウの発現調節機構は不明な点が多いことから、その分子機序を明らかにする研究に関しても並行して進めていきたいと考えている。
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