超高効率ノックインシステムの開発

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K07085
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 相田 知海 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (50540481)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: CRISPR / ノックイン / long ssDNA

研究実績の概要

Cre- loxPシステムを用いたコンディショナルノックアウトマウスは、現代生物学に欠かすことのできない重要なツールである。このシステムには、Creリコンビナーゼを発現するマウス（ノックインマウス）と、標的遺伝子が二つのloxP配列で挟まれているfloxノックインマウスの二つの遺伝子改変マウスが必要である。CRISPRの登場により単純なノックアウトマウスの作製は、従来のES細胞を用いることなく、受精卵の直接改変により、極めて容易に迅速に実現可能になった。一方で、CRISPRを用いたCreリコンビナーゼやfloxノックインマウスの受精卵直接改変による作製は、その基盤となる相同組換えの効率が極めて低いため、依然困難である。平成29年度は、Creリコンビナーゼやflox遺伝子を標的ゲノムに導入するために従来用いられて来た二本鎖DNAドナーに代わり長鎖一本鎖DNAドナーを開発した。さらに長鎖一本鎖DNAドナーと、我々がこれまでに開発してきた高効率CRISPRシステム・クローニングフリーCRISPRを組みわせる事で、マウス受精卵において極めて高いノックイン効率を実現可能であることを示した。様々なCreリコンビナーゼノックインマウス及びfloxノックインマウスを最大100%の極めて高い効率で作出する事に成功した。合計13遺伝子において、Creリコンビナーゼノックインマウス及びfloxノックインマウスを作出し、この手法が極めて頑強であることを示した。そのノックイン効率は、ほとんどの遺伝子座で数十%のレンジであり、３遺伝子においては最大100%に達した。本手法は極めて簡便で、ノックイン効率は極めて高く、様々な遺伝子で同様の効果を発揮し、最短1ヶ月で完了する事から、今後の遺伝子改変マウス作製の標準手法となることが期待される。この本研究成果は論文発表した。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

研究は順調に進展している。特に長鎖一本鎖DNAドナーの開発と、これにクローニングフリーCRISPRを組みわせる事によるノックインの超高効率化、そして従来困難であったCreリコンビナーゼ及びfloxノックインマウス作製への応用を実現し、論文発表に至った。

今後の研究の推進方策

これまでに様々な高効率ノックイン手法を開発してきた。最終年度はそれらのさらなる改良に加え、生物学研究推進のための応用を進めて行く。

次年度使用額が生じた理由

研究の進展により平成29年度の計画を効率的に終了したため、少額の次年度使用額が生じた。次年度の研究計画の効率的な推進に活用する。

研究成果

• [雑誌論文] DEPDC5 deficiency contributes to resistance to leucine starvation via p62 accumulation in hepatocellular carcinoma (2018)
  • 著者名/発表者名: Mizuno Y, Shimada S, Akiyama Y, Watanabe S, Aida T, Ogawa K, Ono H, Mitsunori Y, Ban D, Kudo A, Arii S, Yamaoka S, Tanabe M, Tanaka S
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 ページ: 106
  • DOI: 10.1038/s41598-017-18323-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins (2017)
  • 著者名/発表者名: Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, Buckley SM, Seshacharyulu P, Batra SK, Behlke MA, Zeiner SA, Jacobi AM, Izu Y, Thoreson WB, Urness LD, Mansour SL, Ohtsuka M, Gurumurthy CB
  • 雑誌名: Genome Biology 巻: 18 ページ: 92
  • DOI: 10.1186/s13059-017-1220-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Impaired degradation of medullary WNK4 in the kidneys of KLHL2 knockout mice (2017)
  • 著者名/発表者名: Kasagi Y, Takahashi D, Aida T, Nishida H, Nomura N, Zeniya M, Mori T, Sasaki E, Ando F, Rai T, Uchida S, Sohara E
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 487 ページ: 368-374
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.04.068
  • 査読あり
• [学会発表] Making knock-in mice easy with Cloning-free CRISPR (2017)
  • 著者名/発表者名: Tomomi Aida
  • 学会等名: JSGE Satellite Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Opportunities and challenges in animal model innovation in CRISPR-era (2017)
  • 著者名/発表者名: 相田知海
  • 学会等名: 日本神経化学会
  • 招待講演