|
全長のPEDFを当初に予定していた位置で3分割した結果、得られたフラグメントをさらに分割したペプチドには、in vitro（腎メサンギウム細胞）における、終末糖化産物（AGEs）により惹起した酸化ストレスレベル及び、MCP-1、VCAM-1、PAI-1遺伝子の発現を抑制する効果が得られなかった。そこで、新たにPEDFを分割する位置を変更した。また新たなフラグメントの発現プラスミド作製に際して、Hisタグに加えてGST融合型に変更した。各フラグメントについて、in vitroにおける機能解析をおこなった。その結果、全長PEDFと同様の酸化ストレス抑制作用を有するフラグメントが得られたため、該当フラグメントを6分割したペプチドを作成した。各ペプチドについて、in vitroにおける酸化ストレスアッセイとqPCRによる各種遺伝子の発現を定量したところ、これらを有意に抑制しうる効果はみられなかった。そこで、ペプチドの分割位置を再検討し、4分割したペプチド（P1～P4）を作製した。その結果、全長PEDFと同様に酸化ストレス抑制効果を示すペプチドが得られた。該当ペプチドについて、プロテアーゼ耐性を付与するため、N末端にメチル化を施し、in vitroアッセイを検討した結果、酸化ストレス抑制効果が確認できなかった。そこで、N末端のアルキル化、アセチル化、D体化した修飾ペプチドをそれぞれ作製した。修飾にともない、溶解度の低下がみられたため、溶解bufferの変更により対応した。いずれの修飾ペプチドについても、酸化ストレス抑制効果が確認できなかったことから、現在糖鎖の付加及びポリエチレングリコール鎖の付加を引き続き検討している。
|
