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2016 年度 実施状況報告書

脱ユビキチン化酵素阻害剤が駆動する新規HIF-1分解経路の同定

研究課題

研究課題/領域番号 16K07114
研究機関京都大学

研究代表者

服部 明  京都大学, 薬学研究科, 准教授 (50300893)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード低酸素応答 / 脱ユビキチン化酵素 / プロテアソーム / タンパク質分解
研究実績の概要

本年度は、HIF-1αの各種変異体を用いて、脱ユビキチン化酵素(DUB)阻害剤が誘導するHIF-1α分解に必須なHIF-1α分子内領域の絞り込みを試みた。C末端にHAタグを付加したHIF-1α(野生型HIF-1αHA)発現プラスミドを作製後、C末端欠失変異体HIF-1α(1-600)HA、HIF-1α(1-375)HA発現プラスミドも作製した。さらに、HIF-1αのプロテアソーム分解の過程で必須の翻訳後修飾を受けるLys残基(ユビキチン化修飾)およびPro残基(水酸化)の点変異体であるHIF-1α(3K>3R)HAおよびHIF-1α(2P>2A)HAも作製した。これらプラスミドをヒト肝がん細胞株HepG2に導入し、薬剤選択によってHIF-1αおよびHIF-1α変異体発現安定発現株を樹立した。
得られた各HIF-1α発現細胞株を用いて、プロテアソーム阻害剤刺激後4時間で蓄積した野生型および変異体HIF-1αの発現レベルに及ぼすDUB阻害剤の影響を抗HA抗体を用いたウエスタンブロット解析によって検討した。その結果、野生型HIF-1αHA、HIF-1α(3K>3R)HAおよびHIF-1α(2P>2A)HAはいずれもDUB阻害剤処理によって分解へと誘導された。また、HIF-1α(1-600)HAについても野生型HIF-1αHAと同様の分解傾向が観察された。一方、HIF-1α(1-375)HAはDUB阻害剤処理による分解誘導を受けなかった。以上の結果から、DUB阻害剤刺激によるプロテアソーム非依存的経路を介したHIF-1αの分解には、プロテアソームでの分解に必須な領域とは異なる分子中央に位置する約200アミノ酸からなる領域が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

HIF1α変異体安定発現細胞株の樹立を行うことで、DUB阻害剤によるHIF1α分解関連分子内領域の絞り込みを行うことができた。樹立した細胞株は来年度以降の解析にも有用であり、本研究を効率よく遂行するための途が開かれた。

今後の研究の推進方策

プロテアソーム非依存的HIF1α分解を担うタンパク質分解酵素を同定を、候補となる核内酵素のノックアウト細胞株の作製あるいはノックダウンによって進める。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2016

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] CD9 suppresses human extravillous trophoblast invasion.2016

    • 著者名/発表者名
      Matsumoto, H
    • 雑誌名

      Placenta

      巻: 47 ページ: 105-112

    • DOI

      10.1016/j.placenta.2016.09.014

    • 査読あり
  • [学会発表] 脱ユビキチン化酵素阻害によるHIF-1発現レベルの制御2016

    • 著者名/発表者名
      吹上遼介
    • 学会等名
      第89回日本生化学大会
    • 発表場所
      仙台国際センター他(宮城県)
    • 年月日
      2016-09-25 – 2016-09-27
  • [学会発表] 脱ユビキチン化酵素USP47のポリユビキチン鎖消化機構の解明2016

    • 著者名/発表者名
      福岡啓太
    • 学会等名
      第89回日本生化学大会
    • 発表場所
      仙台国際センター他(宮城県)
    • 年月日
      2016-09-25 – 2016-09-27

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公開日: 2018-01-16  

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