がん治療を目指した遺伝子増幅の抑制の分子基盤の解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K07121
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 古川 龍彦 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (40219100)
• 研究分担者: 井ノ上 逸朗 国立遺伝学研究所, 人類遺伝研究部門, 教授 (00192500) ; 河原 康一 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 講師 (00400482) ; 南 謙太朗 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任研究員 (20735956) ; 山本 雅達 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (40404537)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 遺伝子コピー数変化 / 遺伝子増幅 / がん抑制遺伝子 / 抗がん剤耐性 / 遺伝子修復

研究実績の概要

テトラサイクリン誘導性のBHLHE41発現レンチウイルスの系を確立した。このウイルスをRRM1, MDR1の遺伝子増幅のある細胞株に感染し、経時的にゲノムのコピー数変化を観察した。誘導後に再現性のあるコピー数減少を確認した。現在最適なサンプル回収時期を決定するためにより短い時間での検討を開始した。
ストレプトタグ付加したBHLHE41発現ベクターを作成した。この分子を動物細胞に発現させて、結合タンパク質の同定について条件を検討中である。また、BHLHE41のKnockout細胞を作成し、遺伝子発現の変化についても解析中である。
N-myの増幅細胞株とc-mycのdouble minute, HSRそれぞれの形式の遺伝子増幅株細胞にBHLHE41を導入して強制発現している細胞についてmycのコピー数の変化を調べたが、軽度の減少は見られることもあったがmycのコピー数の減少を再現よく観察することはできなかった。ただし、mycはBHLHE41とDNA結合配列が重複しており特異な相互作用も考えられるので、増殖因子EGFRなど別の遺伝子増幅細胞を用いてさらに解析を行う。
ヒト肺がんでの免疫染色はすでに終了しており、染色の評価と発現と予後の解析の評価を行っている。今年度新たにBHLHE41発現によって肺がん細胞株では細胞数が減少することを見いだしたのでその機序についても解析中である。また、BHLHE41がユビキチン化を受けること、メチル化によって発現が抑制されていることについてのその可能性を見いだした。現在詳細については解析中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初年度に当たり、観察対象の変化の経過が長いので条件検討にも時間を要している。しかし、この条件設定が結果を左右する最も重要な因子であること、また実際はより短い時間で変化が観察可能であることが確認できたので、今後は実験を加速できる条件がそろったと判断している。
一方、肺がん細胞での細胞数の減少などあらたな作用や遺伝子発現制御、タンパク質修飾などについて現象を見いだしており、ノックアウト細胞での遺伝子発現による解析など、当初計画された以外の機能についての解析も進める事ができた点もあることからほぼ順調な進行と判断した。

今後の研究の推進方策

１．テトラサイクリン誘導性にBHLHE41を発現する細胞を単離しており、これらの細胞にドキシサイクリンを添加して、経時的に増幅遺伝子コピー数の低下を観察された採取時期に、上記に細胞からmRNAを単離してRNA-SeqやArray 解析を用いて、BHLHE41発現の誘導に伴って、発現の変化が起こる遺伝子を同定する。
２．テトラサイクリン誘導性のBHLHE41発現細胞からドキシサイクリン添加の後の細胞を用いて、経時的にのFISHを行い、染色体上の増幅遺伝子の変化を観察する。ゲノムDNAについてCGH arrayやSNPchip を用いて増幅遺伝子の範囲を決定するとともに、増幅時とコピー数減少後とのゲノムDNAの変化を捉える。
３．テトラサイクリン誘導性BHLHE41を導入し、ドキシサイクリンの存在によって、myc以外の増幅遺伝子のある細胞株を用いて、コピー数の減少が見られる細胞株を同定する。
４．臨床検体の解析とin silico解析を進める。
研究を推進するために、特に生物学的意義として１. ２．が最も大事であるので今年度はこの作業にある程度集中して取り組む。BHLHE41発現による肺がん細胞株では細胞数が減少についても、がん抑制遺伝子の働きと考えて解析をすすめ、コピー数の減少との接点を探る。さらに名古屋大学のグループとの共同研究を展開の予定であり、これによりBHLHE41との結合タンパク質の解析と遺伝子修復に関する先端的な情報を得ることが可能となったので、成果を上げるために研究を加速させる。

次年度使用額が生じた理由

２８年度の計画実行の一部がずれ込んだために、購入予定を繰り上げて牛胎児血清を購入した。牛胎児血清の高騰もあり、少額の残額の結果となった。残額自体は１万円未満となったため２９年度に残すこととした。

次年度使用額の使用計画

発現解析やCHIPアッセイ、ＣＧＨアレイなどを予定しており、残高自体多くないので十分計画的に使用可能な範囲の金額であると想定している。

研究成果

• [雑誌論文] Thymidine Catabolism as a Metabolic Strategy for Cancer Survival (2017)
  • 著者名/発表者名: Tabata S, Yamamoto M, Goto H, Hirayama A, Ohishi M, Kuramoto T, Astushi Mitsuhashi A, Ryuji Ikeda R, Misako Haraguchi M, Kawahara K, Shinsato Y, Minami K, Saijo A, Hanibuchi M, Nishioka Y, Sone S, Esumi H, omita M, Soga T, Furukawa T, Akiyama S
  • 雑誌名: Cell Report 巻: 19 ページ: 1313-1321
  • DOI: org/10.1016/j.celrep.2017.04.061
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Filamin C promotes lymphatic invasion and lymphatic metastasis and increases cell motility by regulating Rho GTPase in esophageal squamous cell carcinoma. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tanabe K, Shinsato Y, Furukawa T, Kita Y, Hatanaka K, Minami K, Kawahara K, Yamamoto M, Baba K, Mori S, Uchikado Y, Maemura K, Tanimoto A, Natsugoe S.
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 8 ページ: 6353-6363
  • DOI: 10.18632/oncotarget.14087.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Overexpression of carboxylesterase contributes to the attenuation of cyanotoxin microcystin-LR toxicity (2017)
  • 著者名/発表者名: Takumi S, Shimono T, Ikema S, Hotta Y, Chigwechokha PK, Shiozaki K, Sugiyama Y, Hashimoto M, Furukawa T, Komatsu M
  • 雑誌名: Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 巻: 194 ページ: 22-27
  • DOI: 10.1016/j.cbpc.2017.01.008. Epub 2017 Feb 3.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] ATP7B expression confers multidrug resistance through drug sequestration (2016)
  • 著者名/発表者名: Moinuddin FM, Shinsato Y, Komatsu M, Mitsuo R, Minami K, Yamamoto M, Kawahara K, Hirano H, Arita K, Furukawa T.
  • 雑誌名: Oncotarget. 巻: 7 ページ: 22779-90
  • DOI: 0.18632/oncotarget.8059.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] マイクロシスチンLRが誘導するアノイキス抵抗性細胞の低酸素応答 (2016)
  • 著者名/発表者名: 堀田夕貴、内匠正太、橋本海理、塩崎一弘、池田龍二、古川龍彦、小松正治
  • 学会等名: 第３９回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] RNA epigeneticsによる生体制御の基盤研究 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長谷拓朗、大塩郁幹、上田裕子、北恵郁緒里、西本愛、犬伏智子、古川龍彦、辻川和丈
  • 学会等名: 第３９回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] アクテオシドを用いたマイクロシスチンLRおよびファロイジンの細胞毒性の抑制 (2016)
  • 著者名/発表者名: 橋本海理、青木俊二、池田龍二、堀田夕貴、塩崎一弘、古川龍彦、内匠正太、小松正治
  • 学会等名: 第３９回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-01
• [学会発表] 核小体の再編成により細胞分裂を制御する新たなストレス応答と癌治療薬の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 下川倫子, 河原康一, 川畑拓斗, 上條陽平, 白石岳大, 山本雅達, 新里能成, 南謙太朗, 有馬一成, 濱田季之, 古川龍彦
  • 学会等名: 第８９回生化学会大会
  • 発表場所: 仙台国際センター 東北大学川内北キャンパス（宮城県仙台市）
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] エネルギー代謝を制御する核小体ストレス応答の分裂期チェックポイント機構としての新たな役割の解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 川畑 拓斗、河原 康一、下川 倫子、山本 雅達、新里 能成、南 謙太朗、有馬 一成、濱田 季之、古川 龍彦
  • 学会等名: 第４回がんと代謝研究会
  • 発表場所: かごしま県民交流センター（鹿児島県鹿児島市）
  • 年月日: 2016-07-07 – 2016-07-08
• [学会発表] 核小体ストレス応答による細胞分裂監視機構とこれを利用した抗がん剤の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 河原康一、川畑拓斗、下川倫子、上條陽平、白石岳大、山本雅達、新里能成、南 謙太朗、有馬一成、濱田季之、古川龍彦
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会 第11回年会
  • 発表場所: 京都テルサ（京都府京都市）
  • 年月日: 2016-06-15 – 2016-06-17
• [学会発表] 核小体ストレス応答による細胞分裂監視機構と抗癌剤の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 河原 康一、川畑 拓斗、下川 倫子、上條 陽平、新里 能成、南 謙太朗、有馬 一成、濱田 季之、古川 龍彦
  • 学会等名: 第20回日本がん分子標的治療学会 学術集会
  • 発表場所: 別府国際コンベンションセンター（大分県別府市）
  • 年月日: 2016-05-30 – 2016-06-01
• [学会発表] バイオイメージング技術による細胞分裂期チェックポイントとしての核小体ストレス応答の役割の解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 下川 倫子、河原 康一、川畑 拓斗、上條 陽平、新里 能成、南 謙太朗、有馬 一成、濱田 季之、古川 龍彦
  • 学会等名: 第20回日本がん分子標的治療学会
  • 発表場所: 別府国際コンベンションセンター（大分県別府市）
  • 年月日: 2016-05-30 – 2016-06-01
• [学会発表] ATP7Bの発現はドキソルビシンの核から後期エンドゾームへの再局在と抗がん剤耐性に関与する (2016)
  • 著者名/発表者名: 新里能成、南謙太朗、河原康一、古川龍彦
  • 学会等名: 第20回日本がん分子標的治療学会
  • 発表場所: 別府国際コンベンションセンター（大分県別府市）
  • 年月日: 2016-05-30 – 2016-06-01
• [産業財産権] 抗がん剤の感受性及び癌の予後に対する診断マーカー (2016)
  • 発明者名: 河原康一、古川龍彦、下川倫子、川畑拓斗、白石岳大、濱崎研悟
  • 権利者名: 河原康一、古川龍彦、下川倫子、川畑拓斗、白石岳大、濱崎研悟
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2016-172195
  • 出願年月日: 2016-09-02