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IVE(In vivo electroporation)を用いたマウス脳への直接遺伝子導入によるマウス GBM(glioblastoma multiforme)モデルの構築 ― これまでに、申請者が構築したpiggyBac 発現ベクターを用いてIVE法にて新生児マウス側脳室NSCsに直接H-RAS V12 cDNAおよびInk4a/Arf shRNAを導入後、経過観察により腫瘍形成能や病理像について評価を行い、ヒトGBMと酷似した脳腫瘍の形成に成功した。さらに、腫瘍形成の割合を100%にすることを目標にインジェクション条件について検討を行った。遺伝子高発現を目的に高濃度の発現ベクター導入を試行したが、核酸溶液の粘性の問題で脳の形成異常が見られたため、他法の検討が必要であった。近年、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼの精製タンパク質を一般に入手できるようになり、目的細胞でのゲノム編集がより簡便となっただけではなく、CRISPR/Cas9 発現ベクター導入に比べ、CRISPR/Cas9タンパク質導入によりゲノム編集効率も飛躍的に高めることに成功している。これらに倣い、トランスポザーゼ(piggyBac酵素)タンパク質の合成ならびに精製について、①申請者が構築したpiggyBac発現ベクターに分泌シグナルを付加することによる培養細胞上清中へのトランスポザーゼ分泌合成、②大腸菌タンパク質発現システムを用いたトランスポザーゼ合成、の2つの合成システムと、マルトース結合タンパク質(MBP)アフィニティ精製システムを検討した。予備実験として蛍光タンパク質GFPを合成したところ、①②共に十分な合成ならびに精製を確認することができたが、分子量の問題からかトランスポザーゼについては十分な精製タンパク質は得られなかった。現在、①②の最適条件を検討中である。
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