| 研究課題/領域番号 |
16K07142
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立がん研究センター |
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研究代表者 |
武藤 倫弘 国立研究開発法人国立がん研究センター, 社会と健康研究センター, 室長 (30392335)
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| 研究分担者 |
藤井 元 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員 (90321877)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | LDL受容体 / がん予防 / beta-cateninシグナル / エンドサイトーシス |
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| 研究実績の概要 |
疫学的調査により脂質異常症と大腸がん発症との間に関連性があることが示唆されているが、両者を繋ぐ分子メカニズムについては、未だほとんど明らかになっていない。本研究では、LDLR がbeta-cateninシグナル経路に与える影響の分子メカニズムを明らかにする事を第一義の目的とした。
H29年度では、H28年度のマイルストーンから持ち越したLDLR全長分子の強制発現時におけるbeta-cateninシグナル経路変動の解析の課題に取り組んだ。LDLR siRNA導入によって抑制されたTcf/LEF転写活性が、LDLR遺伝子全長を強制発現させるプラスミドの同時トランスフェクションによって回復された。ここでは非翻訳領域にsiRNAを設定した実験系を利用することにより、LDLR-siRNA処理時に他の分子の付加的な変化という要素を排除して、転写活性が回復可能かを検証した。この検討により、純粋にLDLR発現量変動によってTcf/LEF転写活性が変動しうることを示すことができた。
さらにH29年度では、通常培養時、及びLDLR-siRNAを導入してその発現量をノックダウンした時に、クラスリン依存性のエンドサイトーシス特異的な阻害剤 (chlorpromazine)、及びカベオリン依存性エンドサイトーシス特異的な阻害剤(filipin、methyl-beta-cyclodextrin)を添加することで、両分子に依存して機能するエンドサイトーシスをどの程度抑制しているかの確認を行うとともに、各阻害剤添加時のTcf/LEF転写活性をレポーターアッセイによって定量検討した。この結果、chlorpromazineを用いた検討によりクラスリン依存性のエンドサイトーシスの分子機構を用いたエンドサイトーシスがLDLRからbeta-cateninへのシグナル経路において寄与していることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成29年度の達成目標（マイルストーン）は(1) LDLR分子からのシグナル伝達に関連するエンドサイトーシス分子機構の解明 (2) Tcf/LEF転写活性を抑制可能なエンドサイトーシス阻害剤の選定の課題に中心的に取り組み、平成30年度より取り組む有用な阻害剤を用いたMinマウスへのin vivo発がん予防試験への準備を整えることであった。以下に各項目の達成度と課題（遅れている理由）を述べる。
(１)（１）に関しては、計画通りに研究を進めることができた。LDL取込みに於いて主に利用されるクラスリン依存性のエンドサイトーシス機構が、beta-cateninシグナル経路調節時でも利用していることが示せたのは大きな進歩であったと考えている。しかしながら、小胞体／膜トラフィキングを制御する分子などの役割が明らかになっていない。また、薬理学的な阻害作用を利用したクラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害を示してきたが、分子生物学的にノックダウンなどを利用した見当が十分ではない。制御分子の候補を絞ることとその制御に技術的な問題を抱え、時間を要したことが主な遅延の理由として考えられた。
（２）Tcf/LEF転写活性を抑制可能なエンドサイトーシス阻害剤の選定のための検出系の確立に時間を要している。ハイスループットなスクリーニングができるように、アレイスキャンの利用を予定しており、着々と準備を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記に示したように、beta-cateninシグナル経路調節時におけるクラスリン依存性のエンドサイトーシス機構の解析は順調に進んでいるが、これらに於ける詳しい分子メカニズムをより確定化する必要がある。現在、初期エンドソームに局在するRab5の染色および、強発現によりエンドサイトーシスへの影響を検討しているところである。
Tcf/LEF転写活性を抑制可能なエンドサイトーシス阻害剤の選定のためハイスループットなスクリーニング実験系は確立しつつある。蛍光ラベルした小分子の取り込みを指標としているが、positive controlとなるwellの発光量が安定しない。小分子の内容の吟味を初めから行うことも考えている。がん予防動物実験はルーチンに行っており、準備は整っている。本年も、LDLR分子がbeta-catenin シグナル系に与えうる影響とその分子的機構全般について統合的に解明し、3年以内の研究期間の中で有効な化学予防に結びつけたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在までの達成度は、やや遅れている。遅れた分「（２）エンドサイトーシス阻害剤の選定のためハイスループットなスクリーニング実験系の確立」の使用予定額を平成30年度に用いる事により十分に遅れは取り戻せると考えている。本研究はMinマウスへのin vivo発がん予防試験に用いる薬剤選定を目標としており、本年度も並立的な研究費を使用することが推測されるが、進展や検証内容に依って、その使用用途は幾分変動することが予想される。各実験項目遂行に必要な実際の試薬や消耗品の利用度合に応じて、柔軟に経費を使用していく予定である。尚、使用計画において、「設備備品費」、「旅費」、又は「人件費、謝金等」の経費が全体の90%を超えることは無い。使用計画としては、培養関係経費（831,350円）を予定している。
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