| 研究課題/領域番号 |
16K07153
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| 研究機関 | 公益財団法人がん研究会 |
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研究代表者 |
野村 幸男 公益財団法人がん研究会, 経営管理センター 購買・施設部, 総合職 (70714773)
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| 研究分担者 |
新井 正美 公益財団法人がん研究会, 有明病院 遺伝子診療部, 部長 (20232027) [辞退]
石塚 直樹 公益財団法人がん研究会, 有明病院 臨床試験部, 副部長 (50392395)
樋野 興夫 順天堂大学, 医学部, 教授 (90127910)
小林 敏之 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40260070)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | DNAメチル化 / がん / 高解像度融解曲線解析 / リキッドバイオプシー / 超高感度定量解析 |
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| 研究実績の概要 |
前年度までに非臨床材料を使用して、1:10万の超高感度域での定量性のあるメチル化DNAもしくは非メチル化DNA解析法を、高解像度融解曲線解析の改良法として構築し、MLH1とBRCA1遺伝子プロモーター領域について実証した。
本解析法の臨床検体での有用性を実証するため、分担研究者の所属する順天堂大学にて大腸がんを対象として臨床研究を申請し、許可された（課題名：新規開発メチル化DNA解析法の大腸がんにおける有用性の検討。受付番号18-153）。
本申請において解析する遺伝子の1つSEPT9遺伝子プロモーター領域（CpG island領域）のDNAメチル化解析は、リキッドバイオプシー検査としてFDAで認可されている唯一の検査キット「Epi proColon」にて採用されている。リキッドバイオプシーにおける血中循環腫瘍DNAが高度にせん断されていることを踏まえ、100 bp以下の増幅領域でPCR増幅するようオリジナルのPCRプライマーを設計し解析準備を整えた。
また、TSPYL5遺伝子プロモーター領域のCpG island領域について解析系を構築し、BioChain社Tumor Genomic DNA のパネルを解析したところ、乳がん11/40に対し、大腸がんにて39/40と大腸がんに高率でDNAメチル化が生じていることが判明した。これまでTSPYL5が大腸がんにて高度にDNAメチル化されているとの報告はなく、他のがん種を含めリキッドバイオプシーについての報告はない。
現在大腸がん患者の大腸がん組織とその周囲の正常組織、そしてその術前の抹消血、術後一週間の抹消血検体、そして術後1月後の抹消血をセットに検体収集を行い解析準備を整えている。現在までに3症例の早期大腸がん患者の検体セットを収集中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
超高感度で定量的な解析法の構築にあたりターゲットとしたMLH1とBRCA1はそのDNAメチル化と発がんとの関連が早くから知られ、その解析・研究は前者が大腸がんのMSI陽性の原因として治療選択に、また後者が乳がんや卵巣がんにおけるBRCA不活化（BRCAness）の一因として治療選択に有用である。ただし、Liquid biopyにおいては、両遺伝子より高頻度に異常を示す遺伝子のDNAメチル化解析を作成してレパートリーを増やすことが、本解析法の成功率を上げることになる。ただし本解析法に至適化したプライマー設計ソフトウェアは存在しない。現在はDNAメチル化異常を示す可能性の高いCpGサイト探索に、ゲノムブラウザ（複数のウェブサイトを比較し、現在重用しているのはUCSC genome browser） にMethylation hubをTruckとして取り込んで使用している。がんと非がん部で差異のある領域を見出した後、リキッドバイオプシーに適した長さのCpGサイトを選択し、適当なTmを持つようプライマー設計している。作成したプライマーについて市販のヒトがん細胞由来の非メチル化DNAとメチル化DNAコントロールにてPCRを行って特異性の検証を行うことで臨床検体用解析系を構築しているが、これは完全にマニュアルな作業であり、ここに時間がかかることと予想外に成功率の低いことが進捗の遅れの大きな原因である。
また、SEPT９について、鋳型なしでも非特異増幅するケースが散見され、プライマー配列の再設計を行うなど解析系の改良を行ったことも進展の遅れの原因となっている。
また、リキッドバイオプシーはがんの早期診断、早期再発マーカーとして強く期待されており、その検体を解析する研究者が多く需要が高いため入手困難であることも臨床研究の進捗の遅れの原因となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在進行中の臨床研究「新規開発メチル化DNA解析法の大腸がんにおける有用性の検討」にて、新規開発法の臨床材料を用いた実証を行い、有望な結果であれば海外も視野に入れた学会発表を行い、英文投稿を行う。臨床検体を用いた定量解析については、手技の簡便さと超高感度定量性についての新規性を海外に発信するため、仮にリキッドバイオプシーにて陽性検体が得られなくとも、英文雑誌への投稿を行う。
その他、新たにDNAメチル化領域の探索と解析系の構築をすすめ、上記臨床検体での実証をすすめる。
なお、解析系の構築にあたりプライマー選択の優良なソフトウェアがないことが特異的なPCR産物増幅を効率よく得られない原因のひとつであるが、将来のHiQASP用プライマー選択用ソフトウェアプログラムの開発に向けて、プライマーの3’末端に設定するCpGサイトの選択条件と、ForwardとReverseプライマーの組み合わせ条件を拾い上げ、実験にて実証する準備と実践を行う。
また、現在思案中のPCR産物を取り出す必要のない新規のOne Step Nested PCRによる特異的なPCR産物解析を開発し、実証するすることでPCR解析に難解な領域においてもHiQASP解析が可能となるようにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
臨床研究の申請・許可が遅れたことと、検体収集が遅れており、臨床検体解析に使用予定の物品費購入が先送りとなっていることと、そのために結果の論文投稿、学会発表が先送りとなっており、旅費とその他経費も先送りとなっているため。
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