| 研究課題/領域番号 |
16K07158
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| 研究機関 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 |
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研究代表者 |
伊勢 知子 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 創薬デザイン研究センター, プロジェクト研究員 (20771900)
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| 研究期間 (年度) |
2016-10-21 – 2019-03-31
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| キーワード | B細胞受容体 / リン酸化酵素阻害剤 / 部位特異的抗リン酸化抗体 / 薬剤感受性 |
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| 研究実績の概要 |
Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のために、イブルチニブなど様々なＢ細胞受容体シグナル伝達に関与するリン酸化酵素群の阻害剤が開発されている。しかし、その治療効果は、標的リン酸化酵素の発現やリン酸化状態とは必ずしも相関せず、適切な治療薬選択法は確立されていない。そこで本研究では、Ｂ細胞受容体複合体の６つのチロシン残基のうち、我々が初めて作製に成功したＢ細胞受容体ＣＤ１７９ＢのＹ１９６配列特異的抗リン酸化モノクローナル抗体を用い、Ｙ１９６のＢ細胞シグナル伝達における役割とイブルチニブ感受性相関のメカニズムを検討している。平成２９年度の研究では、当初の予定通り、すでに大量精製と蛍光標識が完了している我々独自の抗リン酸化抗体２種を用い（ＣＤ７９ＡのＹ１８８残基、および、ＣＤ７９Ｂ のＹ１９６残基のリン酸化に特異的に検出する抗体）、Ｂ細胞受容体シグナル伝達研究に用いられる様々なヒトＢ細胞株において、他の細胞同定マーカーと同時に用い、多色フローサイトメトリーの染色する条件について至適化を行った。来年度は同一の条件でヒト抹消血単核球の染色を行う予定である。また、いくつかのＢ細胞株のうち、イブルチニブ感受性であったＳＵ-ＤＨＬ-４細胞について、低濃度のイブルチニブの存在下で長期に培養し、イブルチニブの処理濃度を段階的に上昇させる馴化方法により、イブルチニブ耐性ＳＵ-ＤＨＬ-４細胞の樹立に成功した。今後、この細胞株を用いた解析により、これらの部位特異的リン酸化のイブルチニブ感受性との連関の解析を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
２９年度までに目指した、今後の研究のための材料と方法の確立がおおむね順調に進展している。特にフローサイトメトリーを用いた解析では、我々の抗体を用いたB細胞受容体の部位特異的リン酸化に加えて、B細胞受容体の下流シグナルの主要構成要素であるいくつかのシグナル伝達分子のリン酸化を個々の細胞レベルで同時に検討できる抗体パネルを構築した。既に、B細胞受容体の部位特異的リン酸化は我々の抗体によって検出可能であり、そのリン酸化状態は、個々のB細胞株によって異なることがわかっている。今後は、この多色フローサイトメトリーにより、CD79B Y196のリン酸化と下流シグナルの関係を調べることにより、それぞれのリン酸化の意義を解析することができる。
また、イブルチニブ感受性であったSU-DHL-4細胞について、イブルチニブ存在下での長期培養により、イブルチニブ耐性細胞を樹立することに成功した。今後、この細胞株を用いて、CD79B Y196のリン酸化とB細胞受容体の下流シグナルの動きと、イブルチニブ感受性の関係を探って行くことが可能となった。
免役組織染色については、現在までのところ、我々の抗体を用いた染色には成功していない。研究協力者であるKristi Egland博士 (米国サンフォード研究所)の協力を得て、引き続き検討中である。しかし、仮に免疫組織染色に成功しないとしても、フローサイトメトリーによる解析により、本研究を進め、目的の達成を計ることは可能であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、今回構築した抗体パネルを用いて、B細胞受容体及び下流シグナルのリン酸化を個々の細胞レベルで多色フローサイトメトリーによる測定を、正常B細胞や患者サンプルで解析していく。
さらにイブルチニブ感受性細胞と耐性細胞においても、CD79B Y196及びその下流のシグナル分子のリン酸化を解析し、これらのリン酸化とイブルチニブ感受性との連関を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由: ２９年度に予定していた実験が、一部、次年度にずれ込んだため。
使用計画; 次年度の物品費として使用する。
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