| 研究課題/領域番号 |
16K07200
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
守口 和基 広島大学, 理学研究科, 講師 (30294523)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 四型分泌系（T4SS） / プラスミド / 原核ー真核生物間相互作用 / 遺伝子の水平伝播 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は，①供与バクテリア－受容真核生物間親和性が水平伝達へ与える影響。②バクテリア間を動き回るプラスミドの真核生物への伝達。③四型分泌系の持つ真核生物へのDNA輸送能の特異性と可塑性。の3つのテーマを，仮説の検証と真核生物のゲノム改変技術への統合のために解析することにある。本研究での実施予定項目を次に示す。A) 大腸菌－出芽酵母のモデル生物界間接合系を用いた高／低接合効率大腸菌変異株スクリーニング系の開発とKeioコレクションを使ったスクリーニング。B) 有用供与大腸菌株の作製と適用範囲の検証。C) VirB/D4システムによるpCirベクターの移行およびジーンターゲティング効率の検証。D) カウンターセレクション系の検討とモデル植物を使ったゲノム改変植物体の作製。E) T4SS発現カセットの作製とpCirベクター移行能の検証。である。
このうちH28年度は予定通りA), C)に取り組んだ。A)については、約4000株からなる大腸菌のゲノム網羅的ノックアウトライブラリーであるKeioコレクションの全ての株に生物界間接合ベクター（pRS316::oriTP）とT4SSを保持するヘルパープラスミド（pRH220）をそれぞれ導入する作業を行い、生物界間接合用ドナー大腸菌株のライブラリーの作製を完了した。C)については、標的として下流部位欠損型uidA遺伝子を導入したタバコBY-2細胞へ、標的配列をもつpCirベクターをVirB/D4システムで導入したが、ターゲティングによる形質転換体は得られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上記の通りA)の項目については、本年度の目標としていたライブラリー作成を完了することができたため。C)については、計画書に記載の通りリスクのある課題であり、期待した結果は得られなかったが予定通り実験を実施したため。C)は研究申請時より、うまくいかない場合はA) に注力する予定であったので、特に遅れているとは考えていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
C) が継続設定ライン以下の結果であったので、予定通りA)及びそれに続くB)の課題にまずは注力する。生物界間接合用ドナー大腸菌株のライブラリーの作製過程で接合伝達システムを使ってベクターを導入したが、その過程でこれまでの接合に関する報告と異なる事象を観察している。また、C)の解析過程においても、ターゲット配列をもたせたBY-2細胞は、ターゲット配列をもたないコントロールベクターでは通常のランダムインテグレーションによる形質転換効率を示すにもかかわらず、ターゲット配列をもたせたベクターでは形質転換効率が大きく低下するという興味深い事象を観察している。予定通りA)及びそれに続くB)の課題が進行した場合、可能であればH30年度以降にこれらの事象の解析に取り組みたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
１）当初予定していたグレード・容量のディープフリーザーが、交付額内から賄うには研究の実施に支障をきたすため、より廉価で容量の小さいものを購入せざるを得なかったため。２）実施項目A)に関して消耗品を洗浄・再利用して支出を抑えたため。３）実施項目C)に関して期待した結果ではなかったため、見切りをつけたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
労力のかかるスクリーニング作業において、可能であるならアルバイトの雇用費用に充てたい。また、コロニー観察用の実体顕微鏡を購入して作業効率を上げたい。
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