| 研究課題/領域番号 |
16K07202
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| 研究機関 | 学習院大学 |
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研究代表者 |
毛谷村 賢司 学習院大学, 理学部, 助教 (70464386)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | DNA切断修復 / 相同組換え / SMCファミリー |
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| 研究実績の概要 |
DNA相同組換えは、ゲノムDNAの二本鎖切断を修復する機構であり、ゲノムの完全性を維持する上で極めて重要なDNA修復機構である。相同組換え反応において、SMCファミリータンパク質によるDNA構造の制御が重要であると考えられているが、その分子機構についてはよくわかっていない。大腸菌などのバクテリアにおいては、SMCファミリーに属するRecNタンパク質が、相同組換え修復に重要であることがわかっている。そこで、本研究課題では、大腸菌RecNの分子機能について解析を行った。昨年度の解析から、精製したRecNタンパク質は、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAとそれぞれ結合する活性をもち、特に、一本鎖DNAに対する結合能が高いことを明らかにしている。また、RecNはリング状構造を形成し、その中空にDNAを通すようなトポロジカルなDNA結合様式をとりうることを示唆するデータを得ている。これらの結果を踏まえ、本年度は、RecNがコヒーシンと類似したDNA間を接着させる活性があるか検討した。その結果、RecNは一本鎖DNAと二本鎖DNAを接着させる活性を持つことがわかった。また、一本鎖DNAに結合したRecNは、さらに二本鎖DNAと結合することができ、結合した二本鎖DNAもトポロジカルに結合していることがわかった。次に、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを用いて、DNA鎖交換反応におけるRecNの影響について検討した結果、RecNはRecAリコンビナーゼに依存して、この反応を促進することがわかった。以上の結果より、RecNは二つの異なるDNA分子を接着させることで、DNA鎖交換反応を促進していることが示唆された。次に、RecNの機能構造を解析するため、ランダム変異導入法を用いてスクリーニングを行った結果、DNA損傷剤に対して高い感受性を示す機能欠損RecN変異体を複数得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、DNA二本鎖切断修復における大腸菌RecNタンパク質の分子機能の解明を第一の目的としている。本年度は、RecNが真核生物のコヒーシンと類似したDNA分子間を接着する活性を見出すことができた。さらに、その分子メカニズムを解析した結果、一本鎖DNAに結合したRecNが、さらに二本鎖DNAともトポロジカルに結合できることを明らかにすることができた。これらの結果は、DNA損傷部位でRecNとDNAがどのように相互作用しているのかを理解する上で重要な知見である。また、RecNが相同組換え反応の初期過程を再構成したDNA鎖交換反応を促進することを見出したことから、二本鎖DNAの切断を修復するDNA相同組換え反応に、RecNが直接関与することをin vitro実験系で証明することができた。RecNによる相同組換え促進活性が検出可能となったため、今後、この反応におけるRecNの分子動態を詳細に解析することで、相同組換え修復過程において、SMCファミリータンパク質を介した新たな分子モデルを提唱できるものと期待される。当初予定していた研究計画の一部については、上記解析を優先的に進めたことにより進行が遅れているものの、当初の予想以上に興味深い結果が得られているため、総合的には概ね順調に研究遂行されていると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度および次年度の研究結果に基づいて、さらに研究を発展させる。また、3年目に研究開始を予定していた計画内容についても実施する。具体的な研究実施内容については、以下に記す。
１．前年度において、RecNとRecAの直接的な結合を見出している。この相互作用の具体的な重要性は明らかになっていない。そこで、これらの相互作用が、RecNのDNA結合やDNA鎖交換反応の促進に与える影響について解析を行う。また、RecNのATP結合やATP加水分解の重要性について、RecNのDNA損傷部位への結合、DNA構造制御、DNAからの解離の観点から解析を進める。
２．RecNは、構造および機能に重要なドメインやモチーフを持つことが予想されている。本年度、ランダム変異導入法により、RecNの機能欠損変異体を複数単離した。そこで、これらの変異体について、緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いた細胞内局在変化を解析する。また、RecNの予想されるドメインやモチーフの変異体も作製し、同様に解析を行う。さらに、DNA損傷剤に対して高い感受性を示した変異体や局在変化を示した変異体については、野生型と同様にタンパク質精製および生化学的解析を行い、そのドメインやモチーフの機能を明らかにする。
３．出芽酵母のDNA損傷時に働くSMCファミリータンパク質あるSmc5-6へテロ複合体について、DNA損傷依存的な翻訳後修飾と機能制御の観点から解析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた原因として、研究成果の一部において、重要かつ興味深い結果が得られたため、計画を変更して、そちらを優先的に解析を進めた結果、当初予定していた研究内容の一部において計画通り進められなかったことが考えられる。
本年度の残額（336,298円）については、本年度の研究において明らかにした解析結果に基づく更なる研究の推進、および当初予定していた研究内容の実施のため、翌年度（H30年度）に全額使用する予定である。物品費、特に消耗品の消費が多く見込まれるため、翌年度に使用計画している物品費と合わせて使用する。
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| 備考 |
http://www.univ.gakushuin.ac.jp/sci/bio/laboratory/detail-hishida/
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