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ゲノム上の塩基修飾を含めたエピジェネティックな状態は近接する領域の状態により影響を受けることが知られている。その解析方法として修飾酵素をDNA領域に固定して酵素反応を行なわせて効果を調べる間接法は存在しているが、直接的に特定の場所に修飾塩基を導入する方法は現在のところ存在していない。ゲノム上の標的となる遺伝子の上流部分に、in vitroで塩基修飾を施したDNAカセットを直接的に導入する実験手法を開発するだけでなく、5-メチルシトシン等の修飾塩基が近接するエピゲノムの状況からどのように影響を受けるのか、逆に近接領域にどのような影響を与えるのかに関して次世代シーケンサーを用いて解析する手法を開発している。新規部位特異的組み換えシステムであるVCre/VloxPとSCre/SloxPの両方のサイトを使用したDual RMCE (組み換え酵素依存的なカセット交換)法を用いて効率的に外来の遺伝子や修飾されたDNAをゲノム上へ直接的に導入を行なう。本年度はCFP1/CXXC1遺伝子の上流部分に修飾塩基を含むDNAカセットを導入するために作製した受け手側のHEK293細胞(Vlox-Puro-TK-Slox)にNNNN配列(N12個）を含むDNAカセットをVCreとSCreを用いたDual RMCE法で導入した。NNNN配列の分子バーコードを次世代シーケンサー(MiSeq)を用いてシーケンスを行ない、結果を詳細に解析することで、導入されたDNAカセット分子の１分子1分子を区別することが可能となった。更に本解析手法をES細胞で用いることができるように、VCre発現マウス、SCre発現マウスとそれぞれのレポーターマウスを作製した。エピジェネティクス関連遺伝子のノックアウトES細胞を用いて、本解析手法を用いることで、より詳細な解析を行なうことができることが期待できる。
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