| 研究課題/領域番号 |
16K07224
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
青木 弘良 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究領域, 研究員 (50518636)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 一菌体ゲノム解析 / ハイドロゲルマイクロカプセル / 難培養微生物 / 全ゲノム増幅 / 増幅バイアス |
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| 研究実績の概要 |
環境中の多くの微生物は，複雑な培養条件を必要とし，実験室で培養困難な，難培養微生物 (Yet-Unculturable Microorganism, YUM) と呼ばれている．従来YUMの機能は未知であったが，近年環境試料中のDNAを，Phi29 DNA Polymeraseによる全ゲノム増幅 (Whole Genome Amplification, WGA) と，次世代シーケンサーによるメタゲノム解析により，その機能が徐々に明らかになりつつある．しかしメタゲノム解析は，微生物の混合物を解析するため，個々の微生物の機能の同定が困難であった．そこで菌体を単離し，DNA解析する一菌体ゲノム解析が試みられたが，(1) 他のDNAの混入（コンタミ）や，(2) DNAが不均一に増幅され，偏り（バイアス）が生じる，などの課題があった．
そこで内部に単一の菌体を包埋し，外側をアガロースゲルの殻で覆った，アガロースゲル・マイクロカプセル (AGM) を開発した．AGMは直径数10 μmの中空カプセルで，約10 μm厚のアガロースゲルのシェルを持ち，内部にYUMを包埋する液状のコアをもつ．AGMは (1) アガロースシェルによってコンタミを防ぎ， (2) 微細空間内におけるWGAによる増幅バイアスの抑制，が期待できる．しかしこれまでアガロースとアルギン酸コアの微小液滴を，オイル中でゲル化させると沈降するため，簡便にAGMを作製する方法はなかった．そこでアガロース微小液滴をオイルゲル中でゲル化させ，簡便なAGMの作製方法を確立した．比較のため，コア構造のないアガロースゲルビーズとAGMを比べると，アガロースゲルビーズでは，DNAの拡散が妨げられ，増幅が細胞の近傍に限定された．一方AGMでは内部の液状化コア全体に，増幅が見られた．そのためAGMはゲルビーズにくらべ，増幅量が多かった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
オイルゲルによるAGM作製は簡便であるものの，約50-60℃にオイルゲルを加熱する必要があった．今後YUMをAGMに包埋し，培養や生化学分析など，様々な実験に用いる場合，室温の方が望ましい．そこでオイルの種類を検討し，室温で液状のポリグリセリン－６ オクタカプリレート (Polyglyceryl-6 Octacaprylate, PGO) を用いた方法を開発した．PGOは水とほぼ同じ比重のため，アガロース微小液滴が沈降しにくく，浮遊させたまま，ゲル化できる．そこで大腸菌をモデルYUMとしてAGMに包埋し，アルカリ変性後，Phi 29 DNA Polymerase (関東化学) により一次WGAを行ったところ，AGM内で特異的な増幅を確認できた．しかしAGM内の増幅DNA量は約1 ngと，次世代シーケンサでのDNA解析に必要な量 (1 μg) よりも少なかった．そこでAGMを溶解し，内部の増幅DNAを溶出させて二次WGAを行うと，アガロース電気泳動で増幅バンドを確認でき，次世代シーケンサ解析に十分な量のDNAが得られた．一方，直接大腸菌をマイクロマニピュレータで単離しWGAを行うと，電気泳動でバンドが見られず，十分量な量を増幅できなかった．そのためAGMは一菌体のDNAを増幅する方法として，有用であることが示された．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後，二次WGA後の一菌体由来大腸菌DNAを次世代シーケンサで解析し，多数の菌体を解析した結果とくらべ，どのくらい均一性が改善されたか，検証する．また実際にシロアリ腸内原生生物共生細菌 (Okuma, 2015)や，マウス腸内粘膜内微生物難培養微生物，また窒素固定根圏微生物の解析に用い，YUMネットワーク解析への本法の有用性を評価する．
また本方法を特許申請した後，論文，学会等で発表し，本法の普及と社会への還元を図る．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由: 当初予定していた解析用ワークステーションおよび解析用ソフトウェアが，既存のPCと，オープンソース・ソフトウェアで対応できることが判明したため．
使用計画: 繰越分は，消耗品（Phi29 DNA ポリメラーゼ，次世代シーケンサ試薬) 等に使用したい．
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