| 研究課題/領域番号 |
16K07224
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
青木 弘良 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究センター, 研究員 (50518636)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | アガロースゲル・マイクロカプセル / 難培養微生物 / 全ゲノム増幅 |
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| 研究実績の概要 |
自然界には様々な微生物が存在し，様々な相互作用をしながら，複雑な生態系を形成している．多くの微生物は，周囲の微小環境に適応し，複雑な培養条件を必要とするため，難培養微生物(YUM)と呼ばれる．従来YUMの機能は未知であるが，近年環境試料より直接DNAを酵素による全ゲノム増幅(WGA)と，次世代DNAシーケンサー解析(NGS)によるメタゲノム解析により，多くの微生物の機能が解析された．しかしメタゲノム解析では，マイナー集団の微生物の解析が困難であった．そこで直接単離した菌体のWGAとNGS解析が試みられたが，初発DNA量の低下に伴う，WGA増幅の不均一性（増幅バイアス）が顕著になり，全体のゲノムデータが得られない課題があった．増幅バイアス抑制には，反応液量の微量化が有効と考えられるため(Hutchison CA, 2005)，微量反応容器が求められていた．
そこでアガロースゲル・マイクロカプセル(AGM)の開発を行った．AGMは直径数10 μmの中空カプセルで，約10 μm厚のアガロースゲルのシェルと，YUM包埋用の液状コアをもつ．AGMは使い捨てのチューブ内で，２ステップのエマルジョン中でのゲル化と，コアのゾル化により作製する．しかし最初のアルギン酸のエマルジョン中のゲル化は簡便に行えるものの，次のアルギン酸コアとアガロースのゲル化の際，オイルに比べて比重の高いアガロース液滴は，沈降して凝集する課題があった．そのため本研究ではオイル中でのアガロース液滴の沈降防止に着目し，種々の条件を検討したところ，オイルゲルや等比重オイルを用いた沈降防止法を開発し，AGM作製方法を確立した．
従来法として，アガロースをエマルジョン中でゲル化したビーズとWGAを比較すると，ゲルビーズでは包埋した菌体周辺のみ増幅が見られるものの，AGM内ではコア全体で増幅が見られ，増幅量が増大した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまで大腸菌をモデル微生物に用い，AGM内での１菌体WGAとNGSを試みた．1AGMあたり１菌体以下になるように大腸菌をアルギン酸に添加し，大腸菌添加AGM (E.coli--AGM)を作製した．これをアルカリ溶解と中和後，WGAを行い，DNA増幅が見られたAGMをマイクロマニピュレータで単離した．これをNGSに供し，シーケンスデータを解析した．NGSに供したAGMのうち，シーケンスデータが得られるものもあるが，DNA量が必要量に足りず，データが得られないAGMがあった．AGMは微小なため，わずかなDNA量の違いがシーケンス結果に影響すると見られる．そのため現在，増幅量の向上を検討している．
一方，ゲノム情報から推定されたYUMの機能の検証には，微小環境の再構築による，in vitro培養が重要である．微小環境の再構築には，pH，温度，酸素濃度，栄養成分，液性因子など種々の条件を，ゲノム情報を参考に網羅的に検討しなくてはならない．しかし従来の培養器具はバッチ培養を前提とし，このような網羅的な種々の条件の検討や解析には適していない．一方AGMは，内部に微生物を保持したまま，栄養分やバッファーの交換，マイクロ流路内へ高密度集積，および透過観察が可能である．また個々の菌体にくらべ，AGMは100倍以上大きいことから，マイクロマニピュレータでの単離も容易である．そこでAGM内での微生物培養を検討した．これまでAGMの作製では，ジエチルエーテルやアルコールを用いてオイルを除去したが，これらは細菌の細胞膜を溶解し，死滅させる．そのため洗浄条件を検討し，有機溶媒を使用しない，AGMからのオイルの除去方法を確立した．そこでモデル微生物に大腸菌を用い，微生物包埋AGMを作製して培養したところ，コア内での増殖を確認できた．この結果，本方法による微生物の単離培養への有用性が示された．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後AGM内でのDNA増幅量向上を図り，安定してNGSデータが得られるようにする．そのため個々のAGM内DNAの定量，WGA阻害因子の有無，最適なコア径の検討を行う．またAGMを用いたin vitro培養系の構築は，初発菌体量を増やし，NGS効率を改善すると期待される．そのため in vitro 培養系について，基礎的な設計や開発を行う．
そして本法と従来法であるバルクでの一菌体WGAをNGSにより比較し，どのくらい均一性が改善されたか，増幅バイアス抑制効果を検証する．また実際にシロアリ腸内原生生物共生細菌 (Okuma, 2015) の解析に用い，YUMネットワーク解析への本法の有用性を評価する．また本研究を，論文，学会等で発表し，本法の普及と社会への還元を図る．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究期間を１年延長したので，それに伴う消耗品購入に充当する
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