| 研究課題/領域番号 |
16K07249
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
大畑 樹也 浜松医科大学, 医学部, 助教 (80616459)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / ヘテロクロマチン / ダイナミクス |
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| 研究実績の概要 |
転写はクロマチンと呼ばれるヌクレオソーム、タンパク質、RNAが結合した分子複合体の動的な変動を介して制御されている。ほ乳類のメスでは、オスとのX連鎖遺伝子発現量を等量に補正する為に、一本が不活性化される。このX染色体不活性化は機能的長鎖ノンコーディングRNAであるXistが引きおこす。Xist全体を覆う形で逆向きに転写されているアンチセンスRNAであるTsixは、Xistの発現を負に調節する。その際、TsixによってXistプロモーター上には条件的へテロクロマチンが形成される。この様な、発生段階や細胞分化の転写制御機構である条件的ヘテロクロマチンの動的な構造変化に関して、それを制御する因子や機構に関する知見は乏しい。
本提案では、独自のTsix発現誘導系を用いて、Xist遺伝子座における動的な条件的ヘテロクロマチン形成機構のダイナミクスを解明する。本研究成果は、X染色体不活性化の制御機構に留まらず、より一般的な条件的ヘテロクロマチン形成機構の理解に大きく貢献する。
本研究の目的のために独自に開発した実験系であるエピブラスト幹細胞は、ドキシサイクリン添加によるTsixの転写誘導に伴い、Xist プロモーター領域に条件的ヘテロクロマチンが形成される。昨年度は、この独自の実験系を用いて、ユークロマチンから条件的ヘテロクロマチン形成に至るまでの動的な構造変化、特に、変化に至るまでの時間を細かく解析する事で、エピジェネティック修飾群が起こるまでの継時的解析を行なった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までの解析により、Tsixの転写誘導に伴うXist プロモーター領域のユークロマチンから条件的ヘテロクロマチン形成に至るまでの動的な構造変化が明らかになった。それらは、未報告なものも多く含む、ヒストン修飾変化、ヒストンバリアント変化、DNAメチル化変化、ヌクレオソームの配置変化、クロマチンループ形成因子局在変化、クロマチン構造変化などである。
特に昨年度の解析では、ChIPによる微細な変化をより正確に解析するために独自にSpike-in法を開発した。この方法を用いて、Tsixの転写誘導に伴うXist プロモーター領域のユークロマチンから条件的ヘテロクロマチン形成に至るまでのヒストン修飾群の変化の継時的解析を行なった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も、それらエピジェネティック修飾の階層性および機能について詳細な解析を続けていく。階層性については、変化に至るまでの時間を細かく解析する事で（継時的解析）、エピジェネティック修飾群が起こるまでの順序を決定する。現在まではヒストン修飾群の一部の解析しか終わっておらず、引き続き、他のエピジェネティックマークについても詳細な解析を続ける。また、変化を示したエピジェネティック修飾の責任遺伝子候補（ヒストン修飾酵素、DNAメチル化酵素など）をノックダウンし、責任遺伝子を同定する。責任遺伝子をノックダウンし、上流・下流のエピジェネティック修飾に影響がでるか解析する。また、責任遺伝子をノックダウンし、TsixによるXistの抑制が解除されるかも検討する。これらを統合し、Tsixの転写を起点とした条件的ヘテロクロマチン形成のダイナミクス、階層性、及び機能を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由）
ChIPの実験に用いる抗体およびqPCR用の試薬を計画の一部しか購入しなかったため。
（使用計画）
今年度は、前年度の繰越分を、昨年度完成させる予定であった上記実験分の抗体および試薬購入にあてる予定である。
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