| 研究課題/領域番号 |
16K07249
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
大畑 樹也 浜松医科大学, 医学部, 助教 (80616459)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | クロマチン / エピジェネティクス / アンチセンスRNA |
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| 研究実績の概要 |
転写はクロマチンと呼ばれるヌクレオソーム、タンパク質、RNAが結合した分子複合体の動的な変動を介して制御されている。ほ乳類のメスでは、オスとのX連鎖遺伝子発現量を等量に補正する為に、一本が不活性化される。このX染色体不活性化は機能的長鎖ノンコーディングRNAであるXistが引きおこす。Xist全体を覆う形で逆向きに転写されているアンチセンスRNAであるTsixは、Xistの発現を負に調節する。その際、TsixによってXistプロモーター上には条件的へテロクロマチンが形成される。この様な、発生段階や細胞分化の転写制御機構である条件的ヘテロクロマチンの動的な構造変化に関して、それを制御する因子や機構に関する知見は乏しい。
本提案では、独自のTsix発現誘導系を用いて、Xist遺伝子座における動的な条件的ヘテロクロマチン形成機構のダイナミクスを解明する。本研究成果は、X染色体不活性化の制御機構に留まらず、より一般的な条件的ヘテロクロマチン形成機構の理解に大きく貢献する。
本研究の目的のために独自に開発した実験系であるエピブラスト幹細胞は、ドキシサイクリン添加によるTsixの転写誘導に伴い、Xist プロモーター領域に条件的ヘテロクロマチンが形成される。この独自の実験系を用いて、ユークロマチンから条件的ヘテロクロマチン形成に至るまでの動的な構造変化、特に、変化に至るまでの時間を細かく解析する事で、エピジェネティック修飾群が誘導される継時的な変化が明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までの解析により、Tsixの転写誘導に伴うXistプロモーター領域のユークロマチンから条件的ヘテロクロマチン形成に至るまでの動的な構造変化が明らかになった。それらは、未報告なものも多く含む、ヒストン修飾変化、ヒストンバリアント変化、DNAメチル化変化、ヌクレオソームの配置変化、クロマチン形成因子局在変化などである。
また、ChIPによる微細な継時的変化をより正確に解析するためにSpike-in法を用いた解析を行った。これにより、Tsixの転写誘導に伴うXistプロモーター領域のユークロマチンから条件的ヘテロクロマチン形成に至るまでのヒストン修飾群の継時的変化が明らかになった。同様に、パイロシークエンス法を用いてDNAメチル化の継時的な解析も完了した。さらに、一度誘導したTsix発現を再び休止させることで、可逆的な遺伝子発現制御から、Tsix非依存的で不可逆的な遺伝子発現抑制にいたるエピジェネティック修飾の変移も明らかになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
エピジェネティック修飾群のダイナミクス解析に関してはほぼ終了している。再現性を確認する追加実験を行い、本年度中に論文として発表することを目標としている。
また、詳細な動態解析の結果、特定の細胞周期がヘテロクロマチン化に関与する予備的知見を得た。研究をより精緻に達成するため、上記実験を行う。
平行して、変化を示したエピジェネティック修飾の責任遺伝子候補（ヒストン修飾酵素、DNAメチル化酵素など）をノックダウンし、責任遺伝子を同定する。さらに、責任遺伝子をノックダウンし、上流・下流のエピジェネティック修飾に影響がでるか解析する。また、責任遺伝子をノックダウンし、TsixによるXistの抑制が解除されるかも検討する。これらを統合し、Tsixの転写を起点とした条件的ヘテロクロマチン形成のダイナミクス、階層性、及び機能を解明することを今後の研究方針とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
エピジェネティック修飾群のダイナミクス解析（申請書計画IおよびII）に関してはほぼ計画通りに進んでいるが、一部、再現性を確認するための追加実験が必要である。このための実験費用を次年度に繰り越した（抗体や消耗品等、約50万円）。
また、詳細な動態解析の結果、特定の細胞周期がヘテロクロマチン化に関与する予備的知見を得た。これはもともと計画書には予定していなかった新規知見である。本研究をより精緻に達成するため、上記実験のための追加費用も次年度に繰り越した（抗体やFACS消耗品、使用料等、約100万円）。
最後に、申請書に記載してあった計画IIIに相当する、エピジェネティック修飾の責任遺伝子候補（ヒストン修飾酵素、DNAメチル化酵素など）のノックダウンについては、計画が予定よりも遅れている。その実験に必要な費用を次年度に繰り越した（siRNA費用や分子生物学試薬、培養用消耗品等、約130万円）。
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