2016 年度実施状況報告書

複製ストレスチェックポイント制御に関わるRBファミリーの新規分子機能

研究課題

研究課題/領域番号	16K07250
研究機関	浜松医科大学
研究代表者	内田千晴浜松医科大学, 先進機器共用推進部, 准教授 (60223567)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード	DNA複製ストレス / 細胞周期 / RBファミリー
研究実績の概要	本研究では、「DNA複製ストレスチェックポイント制御に関わるRBファミリーの新規分子機能」の解明を目指している。申請者らは、準備研究期間で得たp130RB2とDNA複製ストレス応答因子の相互作用等の結果から、「p130RB2はDNA複製ストレス応答に関与し、ゲノム恒常性の維持に機能する」と考え、これを検証し、RBファミリー(p130RB2)による複製ストレスチェックポイント制御の分子機構を明らかにすることを目的としている。平成２８年度は、以下の実験結果を得た。 U2OS細胞を2 mM Hydroxyurea処理しDNA複製ストレスを与えた条件において、p130RB2ノックダウンにより、複製ストレス初期と持続期の応答に対して異なる影響がみられた。また、複製ストレスによって活性化されるリン酸化酵素および細胞内因性基質と、p130RB2の細胞内局在を蛍光免疫染色法で調べたところ、複製ストレス応答初期においてp130RB2と共局在する複数のタンパク質が明らかとなった。また免疫沈降実験により、p130RB2と結合する複製ストレス応答因子の候補を新たに見出した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 p130RB2ノックダウンは、複製ストレス初期と持続期の応答に対して異なる影響を及ぼすこと、p130RB2と結合する複製ストレス応答因子の新規候補を見出したこと等から、研究計画は比較的順調に進んでいるといえる。
今後の研究の推進方策	今年度は上記のp130RB2結合能を有する複製ストレス応答因子の翻訳後修飾・細胞内局在の変化、さらにRBファミリーの活性欠損による複製ストレス初期応答の変動を解析する。
次年度使用額が生じた理由	計画当初に予想していたp130RB2結合タンパク質に加え、別のタンパク質因子の関与を示唆するデータが得られたため、マウス実験を延期し、培養細胞系での検証を深めることとした。これに伴い実験計画を変更し、予定していた抗体やsiRNAの購入を控えたため。
次年度使用額の使用計画	次年度では、新規に予想されるp130RB2結合タンパク質に対する抗体およびsiRNAのロット検討を行い、効果が明らかで再現性のあるものを必要量購入し実験に使用する。 DOX誘導性安定発現、およびノックダウン細胞株の樹立に必要な試薬・培地・器具類を揃える。また、DNA複製ストレスを誘導する種々の薬剤、複製ストレスの検出系の構築に必要な試薬類を購入する。