| 研究課題/領域番号 |
16K07251
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小林 牧 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (20400690)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | aicda / トポイソメラーゼ１ / RNA編集 / ゲノム不安定化 |
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| 研究実績の概要 |
Top1 mRNAへのAIDによるmiRNA制御を解析するにあたり、トポイソメラーゼ１（Top1） mRNAにAgo2が結合することはmiRNAによるTop1の制御を新たに証明するものであり、mRNAの部分を用いたルシフェラーゼ解析, in vitroでのRNAプローブへのAgo2の結合解析などの結果を総合しTop1 mRNAの3'UTRにAgo2が結合すると当初、推測した。これを根拠にCH12細胞でCRISPR/Cas9法によりTop1 3'UTRをノックインーノックアウトした細胞株を作成し、Top1の変化をRNAとたんぱく質の両方の観点から解析した。予想に反してTop1のmRNAは蓄積するもののタンパク質量は大きく変化せず、その制御がmRNA制御でなく翻訳調節の段階であることが発見された。また、3'UTRノックアウト細胞においてもTop1 mRNAとAgo2結合の強さに変化はなく、Top1 mRNA上のmiRNAの結合部位は、そのcoding領域であることを明らかにした（未発表）。Top1タンパク質量低下はゲノム不安定化に直結し、細胞のがん化メカニズムの一端を説明する。Top1 mRNAへのmiRNAの結合を抑制しTop1タンパク質量低下を防ぐことが可能になれば新規のがん発症予防法の開発が可能となる。現在、Top1 3'UTRのノックアウト細胞と野生型細胞、AIDノックアウト細胞の三種類にFLAGタグ、Histidineタグを融合したAgo2の導入に成功し、クラススイッチに支障がないことを確認している。さらにAgo2の免疫沈降とRNA ligaseを用いる方法でTop1 mRNAに結合するmiRNAの同定を進めており、Top1上のmiRNA結合部位が明らかになれば、その相互作用を制御することは可能である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CH12細胞でCRISPR/Cas9法によりTop1 3'UTRをノックインーノックアウトした細胞株を作成し、これにさらに２つのタグ付きのAgo2を発現させ、同細胞がクラススイッチに関して問題がないことを検証した。タグを用いたAgo2免疫沈降の予備的な実験を行なっており、平成29年度中に候補RNA分子を同定できる可能性が高い。これまでに免疫沈降を用いたRNA回収法について改善を重ねており、ライブラリー作成に必要なRNA量の確保など、今回の実験遂行に十分な準備がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNA ligaseを用いたAgo2抗体免疫沈降により回収するAgo2結合性RNAの解析を進め、AIDの有無により変化するRNA分子を実証し機能解析を行う。現在までに細胞株の樹立が完了しており、今後は免疫沈降実験のプロトコル最適化を経て、次世代シーケンシングによるRNA同定を経て、機能解析へ進む。
Top1はDNA二本鎖構造の維持に働く酵素であるが、AIDに制御されたDNA切断酵素でもある。Top1に相互作用するRNA分子を、Top1-GFP融合分子とGFP免疫沈降法を用いて回収すれば、DNA切断部位で働くRNA分子を同定できると考えられる。Top1はさらにスプライシング複合体の分子とも相互作用することが知られており、RNAを制御する可能性もある。本研究の目的であるAIDによるTop1を通じたゲノム不安定性の制御機構の解明に、このようなRNA解析が貢献する可能性が高く、現在予備実験を進めている。興味深い分子がGFP-Top1分子にAID依存的に濃縮されることを確認している。
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