| 研究課題/領域番号 |
16K07262
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
寺脇 慎一 群馬大学, 大学院理工学府, 助教 (10452533)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | Wntシグナル / DIXドメイン / X線結晶構造解析 / 蛍光共鳴エネルギー移動 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、昨年度決定したAxinとCcd1のDIXドメインで形成されるヘテロオリゴマーの立体構造を元に、分子間相互作用に重要なアミノ酸残基を変異体を用いた結合実験により検証し、また、ヘテロオリゴマー中におけるAxin DIXドメインの位置変化を蛍光共鳴エネルギー移動法(FRET)によって分析して、溶液中での分子状態を検証した。プルダウンアッセイには、結晶構造中でCcd1 DIXドメインとの相互作用に関わるAxin DIXドメインのアミノ酸残基についてアラニンおよび荷電性アミノ酸残基の変異体をもちいた。結合実験の結果、Axin DIXドメインのヘテロオリゴマー形成にのみ特異的なアミノ酸残基を特定することに成功した。また、FRETによる溶液状態の分析では、Axinの位置変化に最適な距離でFRET効率が変動する色素間ペアを複数選定して、Axin DIXドメイン中のシステイン残基をマレイミド基により特異的に標識した。その結果、蛍光標識したAxin DIXドメイン間のFRETシグナルがCcd1 DIXドメインとのヘテロオリゴマー形成によって減少することを見出し、結晶構造から示唆されるヘテロオリゴマー構造の特徴と溶液中で一致することを見出した。
また、昨年度までに構造決定したゼブラフィッシュとマウスのCcd1 DIXドメインが形成するホモオリゴマーの立体構造とその結果見出したホモオリゴマー構造を均一化する変異体等についての研究結果について論文発表をおこなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、前年度決定したAxin-Ccd1ヘテロオリゴマーの立体構造に基づいた変異体結合実験およびFRET分析によって、オリゴマー構造の特徴を溶液状態で分析して、構造と機能の相関を検証した。
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| 今後の研究の推進方策 |
DIXドメインの分子機能についての検証を細胞レベルに拡張して解析を進める。具体的には、細胞内でのFRETによるAxinオリゴマー状態の検証とWntシグナル伝達活性への影響等を今回見出した変異体を利用して解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
変異体作成およびFRET実験の検証が当初の予定通り進展したので、細胞レベルでの実験を検証することが可能になったため、必要な予算を次年度に繰り越して資金を確保したため。
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