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2016 年度 実施状況報告書

ナノ構造体内部への選択的タンパク質取り込み機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 16K07264
研究機関東京農工大学

研究代表者

野口 恵一  東京農工大学, 学術研究支援総合センター, 准教授 (00251588)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワードナノ粒子 / ナノ構造体 / タンパク質シェル構造体 / ウィルス様粒子 / 結晶構造 / X線回折 / 透過電子顕微鏡 / 認識配列
研究実績の概要

エンカプスリンは、分子量 30-40 kDa の単一のタンパク質が自己集合することにより形成される直径 25-55 nmの中空の球状ナノ構造体である。特定の酵素を内包することにより、効率的な反応場や細胞にとって毒性のある基質や生産物を隔離する場を提供する細胞内微小区画であると考えられており、構造体のサイズ、安定性、内包するタンパク質の種類を制御することが可能となれば、マイクロリアクターやマイクロセンサー等としての活用が期待される。本研究では、内包するタンパク質の認識に関わる相互作用を特定することによりタンパク質の取り込み機構を明らかにし、ナノ構造体への外来タンパク質の効率的な内包手法の基盤を確立することを目的として研究を進めている。
これまでに、エンカプスリン内部へのタンパク質の内包に関わる37アミノ酸残基からなる認識配列を推定し、この配列全体を外来タンパク質のC末端に付加することによりエンカプスリンへ外来タンパクが内包可能なことを明らかにした。平成28年度は、エンカプスリンへの内包に必須となる認識配列中の部位を特定するために、外来タンパク質に付加する認識配列の一部を削除し内包実験を行った。エンカプスリンとの内包の可否や効率の検討には、これまでに確立した緑色蛍光タンパク質やルシフェラーゼとの共発現系を用いた。その結果、認識配列のC末端側から15残基程度を削除すると外来タンパク質がエンカプスリンにほとんど内包されなくなった。他方、認識配列のN末端側を削除した場合、これまでのところ、内包に大きな影響を与えないという結果を得ている。したがって、認識配列の中でもC末端側に内包に必須となる部位が存在すると考えられた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成28年度の研究により、エンカプスリンへの内包に関わる認識配列と推定したアミノ酸配列の中でC末端側の15残基の中に内包に必須な領域が存在することが示唆される結果を得た。この領域のアミノ酸残基がエンカプスリン内壁の特定の領域と相互作用することにより内包が制御されていると予想されることから、引き続きアミノ酸残基の特定を進めるとともに、結晶構造解析、タンパク質間生物物理学的相互作用解析、質量分析等の手法で実験を進めることにより、内包機構の解明につながることが期待できる。
また、認識配列のN末端側を削除した場合について、予備的な結果ではあるが、内包効率に影響を与える可能性が示す結果を得ていることから、ナノ構造体への外来タンパク質の効率的な内包手法の基盤に結びつく結果も得られつつある。
以上より,研究全体として,概ね計画通りに進行していると判断した。

今後の研究の推進方策

今後は、内包に必須と予想されたペプチド(10~15残基程度を想定)を化学合成し、エンカプスリンとの複合体の結晶構造解析を行い、エンカプスリン内壁のシグナル配列認識部位を特定する。これまでに、エンカプスリンの分解能3.3オングストロームのX線回折データ収集に成功していることから、平成29年度後半には複合体の結晶化から予備的なデータ収集までは達成できると予想している。シグナルペプチドとの分子間相互作用を評価するために十分な回折データが得られない場合は、結晶化条件の改良や結晶の脱水処理などを行い、分解能の改善を試みる予定である。また、複合体の構造解析は、現在結晶解析を進めているエンカプスリン単独での結晶構造をプローブとした分子置換法で初期構造を得て、構造精密化を行う予定である。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2016

すべて 学会発表 (7件)

  • [学会発表] 熱帯熱マラリア原虫Plasmodium falciparum由来PTEXの発現及び人工膜を利用した機能解析2016

    • 著者名/発表者名
      袴田一晃、渡辺寛和、川野竜司、野口恵一、養王田正文
    • 学会等名
      第89回 日本生化学会大会in仙台
    • 発表場所
      仙台国際センター(宮城県仙台市)
    • 年月日
      2016-09-26
  • [学会発表] オキシステロール結合タンパク質(OSBP)の発現及びOSW-1との相互作用解析2016

    • 著者名/発表者名
      木村真優、山田里佳、福谷洋介、野口恵一、櫻井香里、養王田正文
    • 学会等名
      第89回 日本生化学会大会in仙台
    • 発表場所
      仙台国際センター(宮城県仙台市)
    • 年月日
      2016-09-26
  • [学会発表] 機能性ナノ粒子構築のためのRhodococcus erythropolis N771株由来Encapsulinへの外来タンパク質の導入2016

    • 著者名/発表者名
      藤井基子、田村彰朗、福谷洋介、野口恵一、尾高雅文、養王田正文
    • 学会等名
      89回 日本生化学会大会in仙台
    • 発表場所
      仙台国際センター(宮城県仙台市)
    • 年月日
      2016-09-26
  • [学会発表] 熱帯熱マラリア原虫 <I>Plasmodium falciparum</I> 由来PTEXの発現及び人工膜を利用した機能解析2016

    • 著者名/発表者名
      袴田一晃、渡辺寛和、川野竜司、野口恵一、養王田正文
    • 学会等名
      平成28年度 日本生化学会関東支部例会
    • 発表場所
      自治医科大学医学部教育研究棟(栃木県)
    • 年月日
      2016-06-11
  • [学会発表] オキシステロール結合蛋白質(OSBP)の発現及びOSW-1との相互作用解析2016

    • 著者名/発表者名
      木村真優、山田里佳、福谷洋介、野口恵一、櫻井香里、養王田正文
    • 学会等名
      平成28年度 日本生化学会関東支部例会
    • 発表場所
      自治医科大学医学部教育研究棟(栃木県)
    • 年月日
      2016-06-11
  • [学会発表] マラリア原虫Plasmodium falciprum由来Exp2の発現及び人工膜を利用した機能解析 (Expression and Functional Characterization of the Exp2 from Plasmodium falciprum using Current Analysis)2016

    • 著者名/発表者名
      袴田一晃、渡辺寛和、川野竜司、野口恵一、養王田正文
    • 学会等名
      第16回日本蛋白質科学会
    • 発表場所
      福岡国際会議場(福岡県福岡市)
    • 年月日
      2016-06-07
  • [学会発表] オキシステロール結合蛋白質(OSBP)の発現及びOSW-1との相互作用解析 (Expression of Oxysterol Binding Protein OSBP and interaction analysis with OSW-1)2016

    • 著者名/発表者名
      木村真優、山田里佳、福谷洋介、野口恵一、櫻井香里、養王田正文
    • 学会等名
      第16回日本蛋白質科学会
    • 発表場所
      福岡国際会議場(福岡県福岡市)
    • 年月日
      2016-06-07

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公開日: 2018-01-16  

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