• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2016 年度 実施状況報告書

グレリン受容体を活性化するアルパカ由来ナノボディの作製と結晶構造解析への応用

研究課題

研究課題/領域番号 16K07281
研究機関久留米大学

研究代表者

児島 将康  久留米大学, 付置研究所, 教授 (20202062)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワードグレリン / グレリン受容体 / ナノボディ / アルパカ / パンニング
研究実績の概要

グレリン受容体を無細胞系で発現させ、リポソームに組み込み、これを抗原としてアルパカに免疫した。このアルパカからリンパ球を採取し、mRNAを分離した。ナノボディをコードするIgG、すなわち重鎖一本鎖抗体のIgG2とIgG3をPCRで増幅し、抗原認識部位のcDNAを得た。これを発現ベクターに組み込み、ファージに発現させ、ファージディスプレイ・ライブラリを構築した。
グレリン受容体タンパク質を無細胞系で合成しビオチン化リポソームに組み込んだものを、ストレプトアビジンでコートされた96well マイクロプレートに固定した。固定は室温で2時間行い、そのあと1%BSAのブロッキング液を満たして、非特異的な吸着を抑えるようにした。109~1010/mlのファージ液を200 μl 各well に加え、室温で1時間置いた。リポソームを使っているために洗浄液(PBS)には界面活性剤を含めなかった。PBSで5回ウォッシュし、0.1M グリシン・バッファーでグレリン受容体リポソームに結合したファージを溶出した。コントロールとしてグレリン受容体ではなくアデノシンA2A受容体を用いて同様なパンニング操作を行い、非特異的な吸着を調べた。この結果、上記の条件ではグレリン受容体とコントロールのリポソームの間で、結合したファージ数に差がなく、パンニング操作がうまくいかなかった。
そこでファージ液をコントロール・リポソーム (A2A) に5回連続で結合させて非特異的なファージを出来るだけ除き、そのあとにグレリン受容体リポソームに結合させることにした。さらにブロッキング液として1%BSAとともに1%スキムミルクも検討した。溶出においてもグリシン・バッファーではなく、トリプシン液を使って結合したファージをマイルドな条件で溶出するようにした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

グレリン受容体に対するナノボディ作製において、1年目にファージディスプレイ・ライブラリを完成し、バイオ・パンニングによるスクリーニングにまで進んだ。本年はパンニングの条件設定に取り組んで、非特異的な結合を低下させるための、実験条件やブロック用の試薬、溶出条件などを検討し、現時点での最適なパンニング条件を得た。

今後の研究の推進方策

当初計画のグレリン受容体を活性化するナノボディを取得するために重要な点は、パンニング操作の改良である。
パンニング操作では当初、非特異的な結合が多く、グレリン受容体リポソームとコントロールとの差ができなかった。様々な改良の後に、ようやく両者の差があるパンニング操作を見出したが、それでもその差はわずかである。今後は同様なパンニング操作を3~4回と繰り返し、グレリン受容体に対するナノボディを濃縮していく。
また現在ではパンニング操作に使うリポソームは、免疫につかったものと同じものなので、リポソーム自体に対するナノボディの作製も考えられる。そのために非特異的な結合が多いと想像される。そこでこれを回避するために、パンニングに使うグレリン受容体タンパク質を、現在の無細胞でのリポソームに組み込む合成方法ではなく、昆虫細胞で合成したグレリン受容体を直接スクリーニングプレートに結合させて、これをターゲットにパンニングすることを試みる。
このような改良点から、出来るだけ多くのグレリン受容体認識ナノボディを得て、そのなかから受容体のリガンド結合部位を認識するものを選び出す予定である。

次年度使用額が生じた理由

グレリン受容体に対するナノボディのスクリーニングにおいて、アルパカへのグレリン受容体タンパク質の免疫、採血、リンパ球の精製、cDNAの増幅、ファージディスプレイ・ライブラリの構築とまでは順調に進んだが、パンニングの条件検討に手間取り、予定の消耗品購入の必要性が停止したため。

次年度使用額の使用計画

バイオ・パンニングの条件が整ったため、予定通りの進行で研究を進めるため、使用計画は当初のままで行う。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (3件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Ghrelin improves dystonia and tremor in patients with Rett syndrome: A pilot study2017

    • 著者名/発表者名
      Yuge K, Hara M, Okabe R, Nakamura Y, Okamura H, Nagamitsu S, Yamashita Y, Orimoto K, Kojima M, Matsuishi T
    • 雑誌名

      J Neurol Sci

      巻: 15 ページ: 219-223

    • DOI

      10.1016/j.jns.2017.04.022

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Ghrelin activation and neuropeptide Y elevation in response to medium chain triglyceride administration in anorexia nervosa patients2017

    • 著者名/発表者名
      Kawai K, Nakashima M, Kojima M, Yamashita S, Takakura S, Shimizu M, Kubo C, Sudo N
    • 雑誌名

      Clin Nutr ESPEN

      巻: 17 ページ: 100-104

    • DOI

      10.1016/j.clnesp.2016.10.001

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Ghrelin O-acyltransferase (GOAT), a specific enzyme that modifies ghrelin with a medium-chain fatty acid2016

    • 著者名/発表者名
      Kojima M, Hamamoto A, Sato T
    • 雑誌名

      J Biochem

      巻: 160 ページ: 189-194

    • DOI

      10.1093/jb/mvw046

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] グレリン遺伝子欠損マウスの制限給餌下における自発運動について2016

    • 著者名/発表者名
      御船弘治、原健人、坂井勇介、岩田慎平、西芳寬、田尻祐司、児島将康、満園良一
    • 学会等名
      第89回日本内分泌学会学術総会
    • 発表場所
      京都国際会館
    • 年月日
      2016-04-22 – 2016-04-22
  • [学会発表] 摂餌に関する記憶学習およぼ探索行動に及ぼすグレリンの役割2016

    • 著者名/発表者名
      佐藤貴弘、大石佳苗、児島将康
    • 学会等名
      第89回日本内分泌学会学術総会
    • 発表場所
      京都国際会館
    • 年月日
      2016-04-22 – 2016-04-22
  • [学会発表] 放射線被ばく後のグレリン産生・分泌動態とグレリンによる血球保護効果の検討2016

    • 著者名/発表者名
      西芳寬、那須沙織、細田洋司、御船弘治、久志野彰寛、田中永一郎、児島将康
    • 学会等名
      第89回日本内分泌学会学術総会
    • 発表場所
      京都国際会館
    • 年月日
      2016-04-21 – 2016-04-21
  • [図書] 下垂体疾患診療マニュアル2016

    • 著者名/発表者名
      児島将康(分担)
    • 総ページ数
      285
    • 出版者
      診断と治療社

URL: 

公開日: 2018-01-16  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi