| 研究課題/領域番号 |
16K07284
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構 |
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研究代表者 |
桑原 直之 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 研究員 (70506253)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 筋ジストロフィー / 糖鎖修飾 / X線結晶構造解析 / O-マンノシル化 |
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| 研究実績の概要 |
ジストロフィン糖タンパク質複合体は筋肉や脳神経組織など多くの組織で重要な糖タンパク質複合体であり、細胞内骨格と細胞外マトリックスを物理的に繋げる働きをしている。αジストログリカンはその複合体のサブユニットであり、細胞表面に局在している。αジストログリカンに付加されたO-マンノース型糖鎖が細胞外マトリックスタンパクであるラミニンと直接相互作用し、そのO-マンノース型糖鎖の形成不全が先天性筋ジストロフィーを引き起こす。
本研究ではこのO-マンノース型糖鎖の形成に関わるPOMGnT1及びFKRPなどの構造機能解析を進めた。POMGnT1についてはこれまでに構造機能解析を連携研究者と進めており、平成28年度にPNAS誌に研究結果に発表することができ、複数の国内外の学会で発表を行った。また、この結果により国際シンポジウムThe 3rd International Symposium on Glyco-Neuroscienceにおいて、Excelent poster awardを受けた。FKRPに関しては明らかにした結晶構造に基づいて、疾患関連変異の影響などを連携研究者らと議論し、立体構造に基づいた疾患関連変異の分類を行うとともにFKRP機能不全の回復方法を確立するための準備実験を始めている。また、FKRPと基質との複合体結晶構造解析を進め、FKRPの基質認識機構の解析を進めている。
さらにFKTNやTMEM5などのO-マンノース型糖鎖修飾に関わる酵素群の大量発現及び大量精製のための発現コンストラクトの検討を行い、それぞれについて最適と思われる発現領域の判定を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
連携研究者らのグループがFKRP, FKTN及びTMEM5の基質同定及びそれら糖転移酵素が作成するポストリン酸化修飾構造を明らかにした(M. Kanagawa et al., Cell Reports (2016), H. Manya et al., JBC (2016))。これにより、平成28年、平成29年に計画していたFKTN、FKRP、TMEM5の基質同定がほぼ完了したことになる。FKTNはCore M3と呼ばれるO-マンノース型糖鎖にリン酸化リビトールを転移し、FKRPはその後に再度リン酸化リビトール、TMEM5はその後にキシリトールを転移する。この糖鎖構造はこれまで全生物種で発見されたことのない特異な糖鎖構造であり、さらに哺乳類細胞がリン酸化リビトールを利用する初めての報告である。現在この結果に基づき、それぞれの基質認識機構及び糖転移機構の解析を、X線結晶構造解析及び生化学的解析を行おうとしている。そのため、申請者グループの研究は当初の予定より早く進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
(FKRPの基質認識機構及び糖転移機構解析)FKRPは既に結晶構造を明らかにしており、FKRPの精製及び結晶化は問題なく遂行できている。今後は明らかにした基質を用いて、基質複合体の構造解析を行う。用いる基質は前年度に同定された糖鎖を用いるが、作成できる量が少ないため、精製糖転移酵素を用いた大量作成や基質への親和性が上昇できるFKRP変異体の利用などを用いて基質複合体の解明を行う。明らかにした構造に基づいて変異体を作成し、生化学的解析やFKRPノックアウト細胞を用いた細胞内での解析行い、糖転移機構の解明や筋ジストロフィー発症機構解明に繋げる。
(FKTNの大量精製及び結晶化) FKTNはFKRPの基質であるリン酸化リビトールが付加されたcore M3糖鎖を生成する。そのためFKRPの基質複合体構造解析のためにも、FKTNの大量精製系の確立が重要である。しかしFKTNは哺乳類細胞発現系を用いても不安定であり、大量発現及び精製が困難である。他の蛋白質もしくは化合物などの安定化させる因子が必要であると推測され、これまでに報告のあるPOMGnT1などの候補相互作用因子(蛋白質もしくは化合物)の添加により、安定性の向上を試みる。安定性が向上し、精製系が確立できたのちに、結晶化を進め、リン酸化リビトールやcore M3糖鎖認識機構の解析を行う。
(TMEM5の大量精製及び結晶化)TMEM5はリン酸化リビトールを糖受容体、キシリトールを糖供与体とする新規糖転移酵素である。現在、複数の種からTMEM5遺伝子を取得し、それぞれについて発現領域を変えた哺乳類細胞用発現ベクターを構築する。一過性発現によりそれぞれの発現コンストラクトについて安定性を評価し、結晶化のための発現コンストラクトを選定する。選定したコンストラクトを用いて安定性発現系株を取得し大量精製を行い、結晶化スクリーニングを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
FKTN, FKRP, TMEM5の基質同定が当初予定よりも早く遂行できたため、購入予定の試薬などが不要になった。そのため、未使用額を次年度に持ち越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
FKTN, FKRP, TMEM5の基質複合体の構造解析のための結晶化試薬やそれに関連した消耗品に使用する。
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