| 研究課題/領域番号 |
16K07288
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
小原 圭介 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (30419858)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 脂質 / 脂質非対称 / 細胞膜 / センシング / 真菌感染症 |
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| 研究実績の概要 |
細胞膜の脂質二重層では、内外層で脂質組成や機能が大きく異なる。その様な脂質非対称の状態を、脂質非対称センサータンパク質Rim21が感知する仕組みを解明し、応用研究に向けた基礎知見を得るのが本研究の目的である。
平成29年度は、脂質非対称センサーモチーフ周辺のアミノ酸残基にも注目し変異解析を行った。その結果、センサーモチーフ周辺のあるアミノ酸残基に変異を導入した場合に、Rim21のC末端細胞質領域（Rim21C）と細胞膜内層の親和性が増すことを見出した。私はRim21Cと細胞膜内層との相互作用が脂質非対称の感知において中心的な役割を果たしている事を既に報告しており、今回の結果は、センサーモチーフの周辺配列が脂質非対称センシングの強度や閾値などの微調整に関わっている事を示唆する知見である。また、この変異を導入したGFP-Rim21Cは、通常時での細胞膜への結合がより観察しやすいため、生きた細胞で脂質非対称の状態をモニター可能なバイオセンサーの開発へと繋がる。
私は、脂質非対称のシグナル伝達過程においてユビキチン化反応が必須であることを既に報告している。今年度は、これまでに報告されているRim21のユビキチン化部位とは別の未知のユビキチン化部位が存在し、その未知の部位に対するユビキチン化が、次の分子を細胞膜へリクルートするのに重要であることを示唆する結果を得た。そこで、未知のユビキチン化部位を、リジン残基に対する系統的な変異解析および質量分析、といった二方面から同定することを試みている。現在は変異解析の準備が整った段階である。質量分析に関しては、高純度のユビキチン化Rim21を大量に精製する方法を確立したところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
脂質非対称センシング機構の解明に関しては、センサーモチーフ周辺の配列で、Rim21Cと細胞膜の相互作用に影響を与えるアミノ酸残基を新たに見出した。Rim21Cと細胞膜の相互作用は、脂質非対称センシングにおいて中心的なプロセスであるので、その周辺配列は脂質非対称センシングの強度や閾値を微調整する機能を有すると考えられる。この新しい知見の取得は、今年度の大きな成果である。また、この結果はGFP-Rim21Cを用いた脂質非対称バイオセンサーの開発にも道を拓く可能性が有り、その潜在的な波及効果は大きい。
Rim21Cがこれまでに報告の無い部位でユビキチン化を受けていること、さらにその未知の部位に対するユビキチン化が脂質非対称シグナルの伝達に関わる可能性を示した。このことは、これまで脂質非対称シグナル伝達にユビキチン化が必須であるにも関わらず、既知のユビキチン化部位に変異を導入してもシグナル伝達が正常に進行する、という数年来の矛盾を解消する可能性を秘めている。
病原性真菌類のRim21に関しては、昨年度に出芽酵母と同様の仕組みで脂質非対称を感知している事を示唆したが、今年度はその解析や化合物スクリーニングに向けた準備などは思う様に進行しなかった。私の異動や上記の予想外の進展によって病原性真菌類のRim21の解析に充てる時間が不足したのが原因である。
この様に、予想外・予想以上の成果が得られた部分もあるが、予定通りに進行しなかった部分も有り、総合すると概ね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
脂質非対称センシング機構の解明に関しては、今年度に見出したセンサーモチーフ周辺の重要なアミノ酸残基に関してより詳細な解析を進める。具体的には、脂質脂質非対称センシングにおいて当該アミノ酸残基が関与する素過程を明らかにする。また、これらのアミノ酸残基の発見により、脂質非対称の状態を生きた細胞でモニター可能な脂質非対称バイオセンサーの開発の現実味が増した。これらのアミノ酸残基が細胞膜内層との相互作用に与える影響をより精査することで、将来的にバイオセンサーの開発に繋がる知見を取得する。その一方で、Rim21Cと脂質分子の相互作用解析を引き続き行い、脂質非対称センシングの分子機構に迫る。
Rim21の未知の部位でのユビキチン化について、その部位の特定やユビキチン化の機能を明らかにする。ユビキチン化部位の特定は、リジン残基に対する系統的な変異解析による間接的な同定、および質量分析による直接的な同定の二方面からのアプローチを継続する。ユビキチン化部位が同定できたら、当該部位に変異を導入することで、当該部位へのユビキチン化の機能を様々な角度から調べる。脂質非対称センシングにおけるユビキチン化の機能に関して、蓄積した結果をまとめて投稿論文として発表することを目指す。
病原性真菌類のRim21に関しても並行して研究を進める。今年度に見出したセンサーモチーフ周辺のアミノ酸残基に関して、病原性真菌類で該当する箇所に変異を導入し、細胞膜内層との相互作用が影響されるかを調べる。それにより、脂質非対称センシングにおける当該アミノ酸残基の機能が病原性真菌類でも保存されているか否かを調査する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）今年度は、試薬類の効率的な使用などで想定していたよりも物品費が少額で済んだため次年度使用額が生じた。
（計画）次年度は、今年度に思った様に成果が得られなかった部分（in vitro実験系など）にも力を注ぐ予定である。この部分は、高額な試薬類を消耗するため、次年度使用額は主に消耗品の購入に充てる予定である。
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