| 研究課題/領域番号 |
16K07296
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| 研究機関 | 奈良女子大学 |
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研究代表者 |
渡邊 利雄 奈良女子大学, 自然科学系, 教授 (60201208)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 小胞輸送機構 / Arf1 / Arf6 / SMAP1 / SMAP2 / 神経変性疾患 |
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| 研究実績の概要 |
自ら作製した小胞輸送制御因子（Arf1, Arf1/6, SMAP1/2）を神経組織特異的に欠損したマウス個体と欠損培養細胞とを用い、「神経変性疾患における小胞輸送機構の関与の存在」を、個体レベル・細胞レベルで解明することを目指し、当該年度は以下の研究を予定し実施した。
＜Arf1を神経幹細胞でのみ欠損させたマウスで見られる異常の原因細胞を探る＞ Arf1 を神経幹細胞特異的に欠損するArf1 (flox/flox); Nestin-Creマウスは誕生するが発育不全で、離乳期以降に進行性に運動障害を呈し、誕生後2カ月ほどで死亡した。real time PCRにてArf1欠損を確認した。神経細胞特異的なTau-Creマウスとグリア細胞特異的なCnp-Creマウスとを導入し、Nestin-Creマウスとの交配で見られた異常が見られるのかを確認した。結果、Tau-Creマウスとでは異常が見られ、Cnp-Creマウスとでは異常が見られず、異常の原因が神経細胞であることが強く示唆された。これらの成果は、2016年の第89回日本生化学会大会でシンポジウムを主宰して発表した。
＜SMAP1, 2 を神経幹細胞でのみ欠損させたマウスの解析＞ マウスの繁殖に問題が生じ、現在交配を行いSMAP1, 2 を神経幹細胞でのみ欠損させたマウスが生まれるはずの交配を継続している。
＜Arf1, SMAP1&2欠損MEF細胞特異的な小胞輸送異常を解析する＞
Arf1欠損MEF細胞では「DNA合成中の細胞集団の減少」をFACS解析で明らかにした。SMAP1&2欠損MEF細胞で特異的にみられる異常として、小胞輸送系でのタンパク質分解への選別組織である多胞体(MVB)の肥大化を見出した。SMAP1, 2単独欠損MEF細胞では見られない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
＜Arf1、Arf1&6を神経幹細胞でのみ欠損させたマウスで見られる異常の原因を探り、脳神経レベルで神経変性が見られるかを組織レベルで検討する＞ Arf1に関しては、神経細胞特異的なTau-Creマウスとグリア細胞特異的なCnp-Creマウスとを導入し、異常の原因が神経細胞であることが強く示唆する結果を得て、成果は、2016年の第89回日本生化学会大会でシンポジウムを主宰して発表した。
Arf1&6に関しては、相乗効果を有無を検討する神経幹細胞特異的に欠損するArf1&6 (flox/flox); Nestin-Creマウス作出の交配を継続している。おおむね順調に進行している。
＜Arf1 調節因子（不活性化因子）のSMAP1&2 を神経幹細胞でのみ欠損させたマウスでの異常（離乳以降存在する個体が見られない）の原因を検討する＞ マウスの繁殖に問題が生じ、予定より進行が遅れ気味である。交配数を増やして現在交配を行いSMAP1, 2 を神経幹細胞でのみ欠損させたマウスが生まれるはずの交配を継続している。やや遅れ気味ではあるが、確実に進行している。
＜Arf1, Arf1&6, SMAP1&2欠損細胞で、神経細胞との関連がある因子の小胞輸送異常を神経幹細胞のスフェアー培養、異常マウスの神経細胞とMEF細胞での解析から探索する＞ Arf1欠損MEF細胞では「DNA合成中の細胞集団の減少」をFACS解析で明らかにした。SMAP1&2欠損MEF細胞で特異的にみられる異常として、小胞輸送系でのタンパク質分解への選別組織である多胞体(MVB)の肥大化を見出した。神経幹細胞のスフェアー培養、異常マウスの神経細胞での解析は、現在解析のための実験系を導入すべく、相談を行っている。おおむね順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
＜Arf1、Arf1&6を神経幹細胞でのみ欠損させたマウスで見られる異常の原因を探り、脳神経レベルで神経変性が見られるかを組織レベルで検討する＞ Arf1に関しては、神経細胞特異的なTau-Creマウスを対象として、解析を進める。Nesti-Creマウスとの交配に比べTau-Creマウスでは、より早期に死亡する個体が見られるので、両者の差を検討する。このために、Arf1等の各マウスの戻し交配を進める。Arf1&6 (flox/flox); Nestin-Creマウスを作出し、症状への相乗効果の有無を調べる。Arf1&6 (flox/flox) MEFを作製し、Arf1 KO MEFとArf1&6 KO MEFとの比較から、両者の相乗効果の有無を細胞レベルで検討する。
＜Arf1 調節因子（不活性化因子）のSMAP1&2 を神経幹細胞でのみ欠損させたマウスでの異常（離乳以降存在する個体が見られない）の原因を検討する＞ SMAP1 (flox/flox), 2 (-/-); Nestin-Creマウスで異常が見られるのかを、現在進行中の交配で確認する。
＜Arf1, Arf1&6, SMAP1&2欠損細胞で、神経細胞との関連がある因子の小胞輸送異常を神経幹細胞のスフェアー培養、異常マウスの神経細胞とMEF細胞での解析から探索する＞ Arf1欠損MEF細胞で見られた細胞増殖に2倍の時間がかかる原因を探る。Arf1 KO MEFとArf1&6 KO MEFとの比較から、両者の相乗効果の有無を細胞レベルで検討する。SMAP1&2欠損MEF細胞で特異的にみられる異常の多胞体(MVB)の肥大化の原因と、小胞輸送における効果とを、特にタンパク質分解と関連させて解析する。神経幹細胞のスフェアー培養、異常マウスの神経細胞での解析のための実験系を確立する。
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