| 研究課題/領域番号 |
16K07296
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| 研究機関 | 奈良女子大学 |
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研究代表者 |
渡邊 利雄 奈良女子大学, 自然科学系, 教授 (60201208)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 小胞輸送機構 / Arf1 / Arf6 / SMAP1 / SMAP2 / 神経変性疾患 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、自ら作製した小胞輸送制御因子を神経組織特異的に欠損したマウス（Arf1, Arf1/6, SMAP1/2）個体と欠損培養細胞とを用い、「神経変性疾患における小胞輸送機構の関与の存在」を、個体レベル・細胞レベルで解明することである。
この目的実現のために、本年度は以下の小胞形成制御因子の神経系特異的欠損を引き起こし、神経変性疾患とのかかわりを探るために研究を行い実績を挙げた。
＜Arf1を神経細胞でのみ欠損させたマウスに見られた離乳後の後肢の運動障害とその結果死亡する原因の解明＞ 小脳が小さめであることが判明したので、先端モデル動物支援プラットフォームの協力により、小脳の顆粒細胞数が少ないという異常を明らかにした。しかしながら、共同研究者の研究室移動等の予期せぬ出来事が妨げとなり、この小脳の顆粒細胞数の減少が、直接に後肢の運動障害とマウスの死亡につながる異常であるかの検証まではできなかった。
＜Arf1, 6調節因子のSMAP1, 2を神経系で特異的に欠損させたマウスでの異常の有無の検討＞ SMAP1, 2を神経系で特異的に欠損させたマウスは離乳期以降も正常に生存していることを見出した。同時に血液・血管組織特異的な二重欠損体も作製したが、こちらも正常に離乳し、まだ異常は見られていない。
＜Arf1, Arf1&6, SMAP1&2欠損細胞での解析＞ Arf1&6欠損MEF細胞をタモキシフェン誘導法にて作製し、複数の候補クローンを得た。継代培養時の観察からでは、Arf1欠損と比べて増殖能の亢進や低下は見られていない。DNAタイピングPCRの際に、薄くfloxed遺伝子座と思われるバンドが見られていることから、欠損を直接的にRT-PCRで確認する。神経幹細胞のスフェアー培養は適当な共同研究者が見つからず未着手である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
＜Arf1を神経細胞でのみ欠損させたマウスに見られた離乳後の後肢の運動障害とその結果死亡する原因の解明＞ 先端モデル動物支援プラットフォームの協力により、小脳の顆粒細胞数が少ないという異常を明らかにした。しかしながら、後肢の運動障害とマウスの死亡につながる異常であるかの検証まではできなかった。
＜Arf1, 6調節因子のSMAP1, 2を神経系で特異的に欠損させたマウスでの異常の有無の検討＞ SMAP1, 2を神経系で特異的に欠損させたマウスは離乳期以降も正常に生存していることを見出した。同時に血液・血管組織特異的な二重欠損体も作製したが、こちらも正常に離乳し、まだ異常は見られていない。
＜Arf1, Arf1&6, SMAP1&2欠損細胞での解析＞ Arf1&6欠損MEF細胞をタモキシフェン誘導法にて作製し、複数の候補クローンを得た。RT-PCRでの確認を行っている。神経幹細胞のスフェアー培養は適当な共同研究者が見つからず未着手である。
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| 今後の研究の推進方策 |
＜Arf1を神経細胞でのみ欠損させたマウスに見られた離乳後の後肢の運動障害とその結果死亡する原因の解明＞ 戻し交配が進んだので、再度表現型が維持されているかを確認後、より詳細な死亡原因解析を先端モデル動物支援プラットフォームの協力により行う。
特に既に判明しているArf1欠損MEF細胞での倍加時間の増加に着目して突破口を開きたい。＜Arf1, 6調節因子のSMAP1, 2を神経系で特異的に欠損させたマウスでの異常の有無の検討＞ 影響がないと判断し、この解析はペンディングにする予定である。＜Arf1, Arf1&6, SMAP1&2欠損細胞での解析＞ Arf1&6欠損MEF細胞の確認ができたら、Arf1欠損MEFとの比較を行い、推定されているArf1とArf6の相補機能の有無を検証する。未着手である神経幹細胞のスフェアー培養は、適当な共同研究者を探す。
これらの既定の計画に加えて、以下の2点を新たに行う。
＜全身性のArf1, Arf6の二重欠損の効果の検討＞
推定されているArf1とArf6の相補機能をMEF細胞で検討しようとしているが、より広範な細胞種での検証が可能となることを期待して、同時にマウス個体でも検討する。＜免疫細胞特異的なArf1, 6欠損の解析＞ 神経系での解析がやや遅れているので、今後の研究の広がりも考えて、少し探索対象を広げる。免疫系はそのネットワーク構造の類似、神経系との相互作用があることから、神経系と共通の分子基盤の存在が期待されている。実際Arf1~6の発現を見るとArf1, Arf6の発現が高く、断片的ではあるがArf6の免疫系への機能的な関与の報告もある。そこで、免疫系で比較的高い発現が見られたT細胞、B細胞、マスト細胞特異的に欠損を誘導して、異常が生じるのかを解析する。
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