新規アコニターゼX酵素の機能解析

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K07297
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 渡邉 誠也 愛媛大学, 農学研究科, 教授 (90379032)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: ヒドロキシプロリン

研究実績の概要

本年度は、以下の3項目について研究を遂行した。
①シス-3-ヒドロキシ-L-プロリン（C3LHyp）脱水酵素の触媒メカニズムの解明：アコニターゼX（AcnX）には他のアコニターゼ酵素における4Fe-4S鉄硫黄クラスター結合部位である3つのシステインが保存されていない。そこで、連携研究者である田嶋邦彦氏（京都工芸繊維大学）と共同でESR測定を行った結果、単核鉄の存在を示唆する結果を得た。また、部位特異的変異体の結果から、推定結合部位として2個のシステインと1個のグルタミン酸残基を同定した。
②AcnX遺伝子の生理学的意義の解明：AcnX遺伝子を持つ緑膿菌は、トランス-4-ヒドロキシ-L-プロリン（T4LHyp）を唯一の炭素源とする最少培地ではよく生育するが、C3LHypでは増えない。リアルタイムPCRの結果、C3LHypはAcnX遺伝子は誘導するが、次の反応を触媒するPyr2C還元酵素遺伝子がほとんど発現していないことが分かった（この遺伝子はT4LHypで誘導される）。T4LHypとの共存下では培地中のC3LHypの消費が促進されることから、この仮説は裏付けられた。
③真核微生物と古細菌由来のAcnXの機能解析：本年度はまず、Trichoderma reesei（糸状菌）のAcnX遺伝子の解析を行った。組み換えタンパク質の解析の結果、C3LHyp脱水酵素として機能することが分かった。
成果として、トップジャーナルであるScientific Reportsへ掲載された。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

トップジャーナルであるScientific Reportsへ掲載された。
Watanabe, S., Tajima, K., Fujii, S., Fukumori, F., Hara, R., Fukuda, R., Miyazaki, M., Kino, K. and Watanabe, Y. (2016) Functional characterization of aconitase X as a cis-3-hydroxy-L-proline dehydratase. Scientific Reports 6:38720.

今後の研究の推進方策

AcnXには、単一ポリペプチドのタイプIと2つのポリペプチドからなるタイプIIがある。本年度は細菌とカビのタイプIについて解析が終了したが、タイプIIの機能および生理学的意義についてはいまだ未解明である。最近になって、C3LHypを唯一の炭素源に非常によく生育する細菌を発見し、それがタイプII型AcnXを持つらしい証拠を得ている。上述のようにタイプI型を持つ緑膿菌では生理学的役割が不明瞭であるため、この細菌を用いることでさらなる研究の深化が可能になると考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Functional characterization of aconitase X as a cis-3-hydroxy-L-proline dehydratase. (2016)
  • 著者名/発表者名: 1.Watanabe, S., Tajima, K., Fujii, S., Fukumori, F., Hara, R., Fukuda, R., Miyazaki, M., Kino, K. and Watanabe, Y.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 6 ページ: 38720
  • DOI: 10.1038/srep38720
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] 機能未知タンパク質の新たなアノテーション手法 (2017)
  • 著者名/発表者名: 渡辺誠也
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都女子大学（京都府京都市）
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [図書] Handbook of Microbial Metabolism of Amino Acids (2017)
  • 著者名/発表者名: Seiya Watanabe
  • 総ページ数: 576
  • 出版者: CABI