| 研究課題/領域番号 |
16K07309
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
中村 寛夫 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 専任研究員 (80270594)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ABC トランスポーター / ヘム / 病原菌 / 排出ポンプ |
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| 研究実績の概要 |
黄色ブドウ球菌、連鎖球菌やジフテリア菌のようなグラム陽性病原性細菌は宿主のヘムを奪いとる一方、過剰なヘムの毒性を回避するためにヘム排出ポンプHrtBAを駆動させている。この新規ABCトランスポーターの機能と構造の知見はABCトランスポーターの輸送の仕組み解明という学術理解のみならず、抗菌剤開発の助けになると期待される。申請者は（1）ジフテリア菌由来のHrtBAトランスポーターのATPアナログであるAMP-PNP結合型の結晶構造を明らかにした。ATPaseサブユニットHrtAはダイマー構造で２分子のAMP-PNPがダイマー境界面に結合していた。トランスポーターサブユニットであるHrtBもダイマーでヘリクスI、IIどうしが向き合って接していた。HrtAダイマーの構造はこれまでに明らかにされたABCトランスポーターのATPaseドメインの普遍的構造を支持していた。一方、HrtBダイマーの構造はこれまでに知られていない新規ドメイン構造を提示した。申請者はATP結合によってヘムがかい離することを明らかにしており、今回構造はATPアナログが結合し、ダイマー構造の形成によりヘムがかい離した後の安定な構造であることが示唆された。（2）また、ヘムアナログであるマンガンポルフィリン結合型の結晶を得ることに成功した。マンガンポルフィリンもヘム同様、HrtBAのATPase活性を促進させることが示されたので、結晶中でヘム同様に結合部位に入っているものと考えられる。（3）ヘムやATPなどが結合していないアポ型の結晶を得ることができた。（4）プロテオリポソームを用いた一般的な取り込み法やドナーアクセプターリポソーム法によるヘムアナログ亜鉛ポルフィリンのHrtBAリポソームへの転移の促進が見られなかった。輸送活性を観察する新たな測定系の構築が必要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HrtBAのAMP-PNP結合型の結晶、構造決定は迅速に遂行できた。一方、ヘム結合型では良質な結晶が得られなかった。マンガンポルフィリンもATPase活性を促進させることがわかったので、ヘムの代わりに複合体の結晶化を試みたところ、意外にも5オングストロームほどの分解能をもつ反射データが得られた。ヘム輸送活性の検出に関しては、ATPase活性に依存した輸送を裏付けるデータが得られなかった。これはヘムが水に溶けにくく、試験管、リポソームに付着したり溶液中で凝集するために試験管内の実験が困難であるからと思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでにABC排出ポンプの構造解析で輸送基質の結合が明らかになったものは２例ほどしかない。ヘムエクスポーターの構造は新規性があり、輸送の仕組みを明らかにするためにはマンガンポルフィリン結合型の構造決定が急務である。本年度はマンガンポルフィリン結合型の高分解能の結晶構造解析を目指す。また、アポ型も結晶化の最適化を行う。ヘム輸送の検出には新たな実験系の構築が必要である。疎水性輸送基質の輸送反応を検出した例として、Pg pABCトランスポーターの発見者であるV. Lingの報告がある。これを参考にして、HrtBAプロテオリポソームにテキサスレッド標識したリン脂質を加え、外側表面に蛍光を導入する。輸送基質には蛍光性ヘムアナログである亜鉛ポルフィリンを用いて、脂質膜内でのヘム移動をFRETにより観察する。
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