| 研究課題/領域番号 |
16K07316
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
坂内 博子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 客員研究員 (40332340)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | カルシウム / 神経細胞 / グリア細胞 / イメージング / AMPA受容体 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内カルシウムイオン(Ca2+)の増減「Ca2+シグナル」は、細胞の外界からの情報を適切な生理応答へと変換する役割を担う、普遍的な細胞内シグナルである。しかし、同じCa2+という伝達物質を用いて複数のメッセージを生命暗号としてコードし、多様な生理機能の誘導を可能にする機構については未解明の点が多い。我々は、「Local Ca2+センサー」を作成し、従来法では判別できなかったカルシウムシグナルの由来を特定し、Ca2+シグナルの多様性を記述するための新解析法を確立した。今年度はその技術を用いて、グリア細胞アストロサイトのカルシウムシグナルの研究を行った。本研究を進めるにあたり、Local Ca2+ センサーの発現ベクターを、すべてアデノ随伴ウイルス(AAV)へと移行した。それにより、従来のプラスミドベクターに比べて神経細胞・グリア細胞におけるセンサー発現効率が大幅に上昇した。興奮性神経伝達を担うAMPA受容体はごくわずかであるが、アストロサイトに発現している。そのAMPA受容体の動態を解析したところ、Ca2+透過性のAMPA受容体が存在する可能性が示唆された。そこで、Local Ca2+センサーを用いて細胞膜近傍のカルシウム流入を感度よく検出したところ、たしかにAMPA受容体からのCa2+流入が検出された。先行研究では、小脳バーグマングリアにおいて、AMPA受容体由来のCa2+シグナルが存在し、重要な役割を担うことが報告されていた。本研究により、海馬アストロサイトにも、AMPA受容体由来のCa2+シグナルの存在が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Local カルシウムセンサーをAAVベクターへと移行することにより、神経細胞・グリア細胞での大幅な発現効率上昇に成功した。それにより、従来法では決して見ることができなかった、アストロサイトにおけるCa2+透過性AMPA受容体のチャネル活性を検出することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
同一細胞で２カ所同時にCa2+シグナル測定できるようにするために、波長の異なるセンサー(RCaMP2バージョン)が必要である。RCaMP2バージョンのカルシウム流入センサーはできたが、Ca2+放出センサーはGCaMP6fと異なる局在を示すという問題点がある。そこで今年度は、ER標的配列に改善を加え、超波長Ca2+放出センサーを完成させる。流入・放出のCa2+センサーを同一細胞ラット海馬初代培養神経細胞に発現させ、細胞膜、ERにおけるCa2+シグナルを、NMDA刺激及びmGluR刺激時に測定し、２つの条件下での細胞内４箇所のCa2+シグナルパターンをそれぞれ定義する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
国外出張回数が予定より少なくなったため、今年度の使用額が少なくなった。また、細胞培養方法の改良により、使用実験動物の数を大幅に減少できたことも理由である。
今年度は外部委託あるいは研究補助員の雇用により、研究を加速させる。具体的には、ウイルスの作成を外部委託する費用、培養細胞を作成する研究補助員の人件費として支出する。また、研究補助員によるデータ解析のスピード化をはかるため、計算機を購入する。
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